高脂血癥性胰腺炎患者尿樣的代謝組學(xué)

趙嚴 吳建兵 潘立 張小雷 邱云平 蘇明明 賈偉 王興鵬

高脂血癥性胰腺炎患者尿樣的代謝組學(xué)

趙嚴 吳建兵 潘立 張小雷 邱云平 蘇明明 賈偉 王興鵬

目的基于氣相色譜質(zhì)譜的代謝組學(xué)分析方法，研究高脂血癥性胰腺炎(HLP)患者尿樣。通過對其尿樣代謝物組的分析和生物標記物的發(fā)現(xiàn)，尋找HLP的代謝變化，探討代謝組學(xué)在急性胰腺炎(AP)中的應(yīng)用。方法取24例HLP患者尿樣及40例年齡、性別匹配的正常健康人尿樣，樣品經(jīng)預(yù)處理、衍生和氣相色譜質(zhì)譜分析后，利用正交偏最小方差判別分析(OPLSA-DA)的方法，觀察健康組和HLP組的代謝輪廓差異。結(jié)果上述方法能清晰地將HLP患者和健康人樣本分開，通過NIST、Wiley等譜庫搜索分析了21個代謝物(可信度gt;700)。其中用標準品鑒定之后，發(fā)現(xiàn)與健康組比較HLP患者尿樣中煙酸、烏頭酸、檸檬酸、馬尿酸、對-羥基苯乙酸、對-羥基苯丙酸含量下降；色氨酸、酪氨酸、酪胺、棕櫚油脂、硬脂酸等物質(zhì)含量上升。代謝組學(xué)研究顯示HLP患者三羧酸循環(huán)、腸道菌群結(jié)構(gòu)、脂肪代謝及氨基酸代謝等發(fā)生改變。結(jié)論HLP患者和正常人尿樣代謝譜之間存在差異，而且可能從代謝組學(xué)分析中找出特異的標志性代謝產(chǎn)物，闡釋該疾病的代謝變化；表明利用代謝組學(xué)研究尿液中的代謝物，可以為HLP的診斷和發(fā)病機制提供一個可借鑒的手段；代謝組學(xué)分析是一種有良好發(fā)展前景的研究方法。

代謝組學(xué)； 氣相色譜質(zhì)譜法； 高脂血癥性胰腺炎； 尿液； 生物標記物

在我國，由于近十幾年來飲食結(jié)構(gòu)的改變和對高脂血癥認識的加強，高脂血癥性胰腺炎(hyperlipidemic pancreatitis，HLP)已經(jīng)成為急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)的常見病因之一。代謝組學(xué)主要研究生物對外源性物質(zhì)所引起的病理生理反應(yīng)，以及對遺傳變異的應(yīng)答和內(nèi)源性代謝物的動態(tài)變化，通過對生物體液和組織中隨時間改變的代謝物進行檢測、確定、定量和分類，將這些代謝信息與病理生理過程中的生物學(xué)事件關(guān)聯(lián)起來，以監(jiān)測活細胞中的化學(xué)變化。本課題組采集HLP患者和健康人尿樣，運用代謝組學(xué)技術(shù)分析HLP患者尿中代謝物的共性，以期發(fā)現(xiàn)生物標記物，探索HLP診斷和治療的新方法與新途徑。

材料與方法

一、研究對象

收集2006年10月至2008年3月在山西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院及上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一人民醫(yī)院收治的24例HLP患者，并從各自醫(yī)院體檢中心選擇與患者年齡、性別等因素相匹配的健康人樣本進行比較。HLP的診斷標準是：(1)具有AP的臨床表現(xiàn)，符合中華醫(yī)學(xué)會消化病學(xué)分會胰腺疾病學(xué)組制定的標準[1]；(2)入院時(治療前)的血TG≥11．3 mmol/L，或TG在5.6～11.3 mmol/L，但血清呈脂濁者；(3)排除膽道疾患、酗酒、藥物、腫瘤、外傷等病因。

二、尿液氣相色譜-質(zhì)譜(GC/MC)分析

所有患者以及正常人均簽署同意書，詳細說明本研究的目的和方法。樣本收集前一天要求食用清淡飲食，避免海鮮以及辛辣食物，并禁止飲酒與吸煙，以減少食物對代謝造成的波動。

留取晨起第一次尿液，分裝eppendorf管，置-80℃保存。試驗前1 h取出尿液樣品，室溫下解凍搖勻，10 000離心10 min，取上清按文獻[2]的方法進行氯甲酸乙酯(ECF)衍生化處理。操作步驟為：吸取離心后的尿液上清600 μl于具塞玻璃試管，加入內(nèi)標物0.1 mg/ml氯苯丙氨酸100 μl混勻；再加無水乙醇400 μl、吡啶100 μl以及ECF 50 μl,震蕩混勻10 s，超聲反應(yīng)1 min；反應(yīng)后加入氯仿300 μl，漩渦震蕩30 s，以3 000 rpm離心3 min；加7 mol/L NaOH 100 μl調(diào)節(jié)水層pH至9～10，再加ECF 50 μl，振蕩10 s,超聲反應(yīng)1 min；振蕩混勻30 s,3 000 rpm離心10 min；棄水層，氯仿層加入少量無水硫酸鈉，上GC/MC聯(lián)用儀(AutoSystem XL Gas Chromato-gram/TurboMass Mass Spectrometer，Agilent 6890，USA)分析，采用的石英毛細管色譜柱為DB-5MS (5% Diphenyl cross-linked 95% dimethy-lpolysi-loxane:30 m×250 μm i.d.,0.25 μm;Agilent Jamp;W Scientific,Folsom,CA)。

尿樣GC/MS分析條件：(1)不分流進樣。進樣量1 μl。進樣口溫度260℃，離子源溫度200℃，接口溫度220℃。載氣為氦氣，載氣流速1 ml/min。升溫程序為80℃，0～2 min；以10℃/min速度升至140℃，維持2～8 min；以4℃/min速度升至240℃，維持10～35 min；以10℃/min速度升至280℃，維持36～40 min;再保持40～43 min。(2)質(zhì)譜條件為溶劑延時3 min；電離方式EI；電子能量70eV;質(zhì)譜掃描范圍：m/z30～550;采用全掃描方式。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

先用非監(jiān)督主成分分析(PCA)用來總體考察正常人和HLP患者尿樣中總體代謝模式的差別，然后采用有監(jiān)督的正交偏最小方差判別分析(OPLS-DA)的多維統(tǒng)計方法來鑒別用于區(qū)分各組別間代謝輪廓貢獻較大的代謝物。多維統(tǒng)計中找到的差異代謝物需要進行單維驗證的方法對多維的結(jié)果進行驗證。

對差異代謝物使用NIST、Wiley、NBS和上海交通大學(xué)藥學(xué)院系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)試驗室建立的ECF標準品數(shù)據(jù)庫進行結(jié)構(gòu)鑒定。

結(jié) 果

一、尿樣分析的總離子流圖和OPLS-DA模型

健康人和HLP患者尿液經(jīng)GC/MS分析得到的總離子流圖(TIC)見圖1。

采用OPLS-DA的方法對兩組樣本建模。將Y值設(shè)定為0/1的矩陣(健康人設(shè)為0，HLP患者設(shè)為1)，可以將正常人與HLP患者完全分開，獲得良好的區(qū)分模型(圖2)。

圖1HLP患者(紅色)和健康人(綠色)尿樣的總離子流色譜圖

圖2 HLP患者和正常健康人尿樣的OPLS-DA分析圖

二、差異代謝物的分析

本試驗共發(fā)現(xiàn)142個差異代謝物，其中可信度gt;700有21個代謝物(表1)。HLP患者較健康人升高的代謝物有15個，降低的有6個。對這些物質(zhì)進行生化解釋，它們與三羧酸循環(huán)、腸道菌群的結(jié)構(gòu)改變等相關(guān)。

表1 HLP患者與健康人尿樣間的差異代謝物

討 論

目前認為，高脂血癥是繼膽源性和酒精性之后AP的常見原因。高脂血癥引發(fā)AP的發(fā)病機制復(fù)雜，預(yù)后差，復(fù)發(fā)率高，有重癥化傾向。代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后新近發(fā)展起來的一門學(xué)科，是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分。通過考察生物體受刺激或擾動后其代謝產(chǎn)物隨時間的變化來研究生物體代謝途徑的一種技術(shù)。主要檢測手段是磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)、質(zhì)譜(mass spectrometry, MS)等。通過檢測一系列樣品的峰譜，再結(jié)合模式識別方法，可以判斷生物體的病理生理狀態(tài)，并有可能找出與之相關(guān)的生物標志物。

近年來研究認為，腸道菌群在宿主的營養(yǎng)、代謝以及保護宿主免受外界侵襲等方面起著重要的作用。很多疾病的發(fā)生、發(fā)展也與腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化密切相關(guān)[4]。AP時的腸道菌群易位[5]和腸源性內(nèi)毒素血癥構(gòu)成對機體的第二次打擊，導(dǎo)致胰腺組織繼發(fā)感染和炎癥遞質(zhì)級聯(lián)反應(yīng)。大量細菌學(xué)研究表明[6]，AP的繼發(fā)感染為腸道菌群移行所致。重癥急性胰腺炎時腸道內(nèi)需氧的革蘭陽性腸球菌與革蘭陰性腸桿菌的數(shù)量顯著增加，使內(nèi)毒素生成增加，腸道成為巨大的毒素池；而腸道內(nèi)專性厭氧的雙歧桿菌、乳酸桿菌和類桿菌數(shù)量明顯下降，導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)。本試驗采用GC/MS的方法測定健康人、HLP患者尿樣的代謝物，發(fā)現(xiàn)了21個差異物質(zhì)構(gòu)成的代謝物譜，一些含苯基的代謝物，包括馬尿酸、苯乙酸、對羥基苯乙酸、對羥基苯丙酸等在HLP患者中發(fā)生了紊亂。這些代謝產(chǎn)物主要是腸道菌群對酚類物質(zhì)代謝產(chǎn)生的，表明腸道菌群結(jié)構(gòu)在HLP發(fā)病過程中的改變。

本試驗還發(fā)現(xiàn)一些三羧酸循環(huán)的中間代謝物，如檸檬酸、烏頭酸的含量在HLP患者尿樣中降低，表明HLP患者發(fā)病過程中其有氧能量代謝通路受到抑制。三羧酸循環(huán)的主要代謝酶存在于亞細胞器線粒體中。目前已知線粒體功能異常與心腦血管、糖尿病、腫瘤、神經(jīng)退行性病等相關(guān)，它與HLP的發(fā)病關(guān)系需要進一步探討。

棕櫚油脂、硬脂酸是2種長鏈不飽和脂肪酸代謝產(chǎn)物，在HLP患者中亦有明顯升高，過多的游離FFA可引起胰腺細胞內(nèi)Ca2+升高[7]，誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而引起細胞凋亡，加重胰腺腺泡細胞的損害[8]，導(dǎo)致HLP發(fā)生。進一步證實游離脂肪酸對胰腺腺泡細胞存在的損傷作用。

綜上所述，對HLP患者尿液進行氣相色譜質(zhì)譜的代謝組學(xué)分析，顯示三羧酸循環(huán)、腸道菌群結(jié)構(gòu)、脂肪代謝、氨基酸代謝、線粒體功能等發(fā)生改變，從另一角度闡釋該疾病的生物學(xué)本質(zhì)。

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2008-08-04)

(本文編輯：呂芳萍)

Metabonomicsstudyofurinesamplesofpatientswithhyperlipidemicpancreatitis

ZHAOYan,WUJian-bing,PANLi,ZHANGXiao-lei,QIUYun-ping,SUMing-ming,JIAWei,WANGXing-peng.

DepartmentofGastroenterology,ShanghaiFirstPeople′sHospital,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200080,China

ObjectiveMetabonomics method based gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS) were used to analyze the urine samples of patients with hyperlipidemic pancreatitis (HLP) to describe the characteristics of metabolism changes of HLP, identify potential biomarkers, and investigate the role of metabonomics study in the management of AP.Methods24 patients of HLP and 40 age, sex matched volunteers were enrolled and their urine samples were collected. The urine samples underwent preparation, derivation and GC/MS analysis, Orthogonal-Projection to Latent Structures-Discriminant Analysis (OPLS-DA) were performed to detect the metabolic profile difference between the HLP and control group.ResultsHLP patients can be precisely distinguished from healthy controls. 21 metabolites (credibility gt;700) were identified using the reference compounds available in the libraries of NIST and Wiley. It was identified that levels of nicotinic acid, aconitic acid, citric acid, hippuric acid, hydroxyphenylacetic acid, hydroxyphenyl-propionicacid were decreased, while the levels of tryptophan, tyrosine, tyramine,16-hexadecanoic acid,18-octadecanoic acid were increased. It was also suggested that there was change in tricarboxylic acid cycle and gut bacterial flora, as well as fat metabolism and metabolism of amino acid.ConclusionsThere are differences between healthy controls and HLP patients in the term of GC/MS metabolic profiling, and the biomarkers in the metabolites could be found through metabonomics analysis, and the mechanisms of the metabolic changes could be explored. It was noted that the research of metabolites in the urine samples may be a useful tool to help diagnose and understand the pathogenesis of HLP. Metabonomics analysis is a promising research method.

Metabonomics; Gas chromatography-mass spectrometry(GC/MS); Hyperlipidemic pancreatitis(HLP); Urine; Biomarker

Correspongdingauthor:WANGXing-peng,Email:wangxp1965@yahoo.com.cn;JIAWei,Email:weijia@sjtu.edu.cn

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.02.004

山西醫(yī)科大學(xué)青年基金(02200702)

200080 上海，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一人民醫(yī)院消化科(趙嚴、張小雷)；山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院消化科(趙嚴)；同濟大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第十人民醫(yī)院消化科(王興鵬)；上海中醫(yī)藥大學(xué)(吳建兵、張小雷)；上海交通大學(xué)藥學(xué)院(潘立、邱云平、蘇明明、賈偉)

王興鵬，Email:wangxp1965@yahoo.com；賈偉，Email:weijia@sjtu.edu.cn