L-精氨酸誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性慢性胰腺炎大鼠模型的可行性分析

滿曉華 趙航 徐克群 龔燕芳 高軍 杜奕奇 許愛芳 李兆申

L-精氨酸誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性慢性胰腺炎大鼠模型的可行性分析

滿曉華 趙航 徐克群 龔燕芳 高軍 杜奕奇 許愛芳 李兆申

目的初步探討L-精氨酸誘導(dǎo)慢性胰腺炎大鼠動(dòng)物模型的可行性。方法將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按完全隨機(jī)法分為對照組及精氨酸12、24 h和7 d組，每組10只，間隔1 h分兩次腹腔內(nèi)注射L-精氨酸溶液造模。造模后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)檢測血淀粉酶、血糖水平，對胰腺組織進(jìn)行病理評分，Van Gieson法對胰腺膠原纖維染色。結(jié)果對照組及精氨酸12、24 h和7 d組的血淀粉酶水平分別為(1 634±890)U/L、(3 872±2 676)U/L、(3 307±2 197 )U/L 和(1 561±304)U/L，精氨酸7 d組血淀粉酶水平顯著低于12 h和24 h組(Plt;0.05)，恢復(fù)到對照組水平。各組間血糖水平無明顯差異。對照組及精氨酸12、24 h和7 d組胰腺的病理分值分別為0.8±0.4、5.1±2.6、6.5±2.2和4.5±1.6，精氨酸7 d組胰腺病理評分顯著低于24 h組(Plt;0.05)，但仍顯著高于對照組(Plt;0.05)。精氨酸7 d組膠原染色范圍明顯增加，其他各組未見明顯膠原染色。結(jié)論L-精氨酸腹腔注射后7 d可引起胰腺組織纖維化及管狀復(fù)合結(jié)構(gòu)增生，可用于探索慢性胰腺炎大鼠模型。

胰腺炎，慢性； 精氨酸； 模型，動(dòng)物； 大鼠

L-精氨酸腹腔注射可以成功誘導(dǎo)急性胰腺炎動(dòng)物模型，以往沒有研究嘗試應(yīng)用精氨酸誘導(dǎo)慢性胰腺炎(chronic pancreatitic, CP)。我們前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，精氨酸注射后7 d，大鼠胰腺組織顯著萎縮，被肉芽組織增生取代，同時(shí)伴有導(dǎo)管增生和漿細(xì)胞浸潤。本項(xiàng)研究就精氨酸誘導(dǎo)CP大鼠模型的可行性進(jìn)行分析。

材料和方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康雄性Sprague-Dwley(SD)大鼠，體重250～300 g，SPF級，由第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。在室溫20～28℃、相對濕度40%～70%的動(dòng)物房內(nèi)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前12 h起禁食，不控制飲水。

按完全隨機(jī)法將大鼠分為對照組及胰腺炎12、24 h和7 d組，每組10只。將L-精氨酸粉劑溶于生理鹽水配制成20%溶液，調(diào)節(jié)pH值至7.6～7.8。在劍突下3 cm中線位置進(jìn)針，注射20% L-精氨酸溶液1 ml/100 g體重，間隔1 h后，重復(fù)注射1次。注射后大鼠禁食，可自由飲水，觀察大鼠一般情況。在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)處死各組大鼠，獲取血液、胰腺、肺臟標(biāo)本。對照組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。

二、血淀粉酶、血糖檢測

采用HITACHI-7150型自動(dòng)生化分析儀測定。

三、胰腺組織病理檢查及膠原染色

取胰頭部胰腺組織2～3塊，常規(guī)標(biāo)本固定、石蠟包埋、切片、HE染色，按照Schmidt等[1]標(biāo)準(zhǔn)從胰腺水腫、壞死、出血和炎細(xì)胞浸潤4個(gè)方面進(jìn)行評分。同時(shí)，應(yīng)用Van Gieson法進(jìn)行膠原纖維染色。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)及方差分析，并進(jìn)行正態(tài)分布驗(yàn)證，樣本率比較采用χ2檢驗(yàn)，取α=0.05為臨界值。

結(jié) 果

一、血淀粉酶、血糖的變化

對照組及精氨酸12、24 h和7 d組的血淀粉酶水平分別為(1 634±890)U/L、(3 872±2 676)U/L、(3 307±2 197 )U/L和(1 561±304)U/L。精氨酸7 d組的血淀粉酶水平顯著低于精氨酸12 h和24 h組(Plt;0.05)，恢復(fù)到對照組水平。對照組及精氨酸12、24 h和7 d組血糖水平分別為(6.5±1.7)mmol/L、(5.2±1.5)mmol/L、(5.0±1.1)mmol/L和(6.3±2.2)mmol/L，各組間無明顯差異(Pgt;0.05)。

二、胰腺病理改變

對照組胰腺大體呈粉紅色，組織柔軟，胰膽管清晰可見。光鏡下見胰腺組織結(jié)構(gòu)清晰，腺泡小葉完整，間質(zhì)無滲出；精氨酸12、24 h組大鼠可有少到中量腹水，腹水混濁，呈灰黃色或暗紅色。胰腺大體可見明顯充血、水腫、出血，部分大鼠可見黃白色鈣皂斑。光鏡下見12 h組胰腺間質(zhì)內(nèi)大量炎細(xì)胞浸潤，散在分布的壞死胰腺腺泡細(xì)胞及出血，腺泡實(shí)質(zhì)內(nèi)見紅細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤。24 h組胰腺組織損傷更加嚴(yán)重，腺泡結(jié)構(gòu)明顯破壞，大片壞死組織，大量炎細(xì)胞浸潤，間質(zhì)脂肪組織內(nèi)可見出血、壞死；精氨酸7 d組胰腺組織體積明顯減小，光鏡下見肉芽組織增生，充血，水腫，急、慢性漿細(xì)胞浸潤，小導(dǎo)管增生，腺泡數(shù)量明顯減少(圖1)。對照組、精氨酸12、24 h和7 d組胰腺的病理分值分別為0.8±0.4、5.1±2.6、6.5±2.2和4.5±1.6，精氨酸7 d組胰腺病理評分顯著低于精氨酸24 h組(Plt;0.05)，但仍顯著高于對照組(Plt;0.05)。

三、胰腺膠原染色

對照組幾乎無膠原染色。精氨酸12、24 h組胰腺有少許膠原染色，主要位于小血管分布區(qū)域，小葉間隙及實(shí)質(zhì)中無膠原染色。精氨酸7 d組膠原染色范圍明顯增加，包括增生的小導(dǎo)管區(qū)域，在小葉間隔及胰腺實(shí)質(zhì)內(nèi)也可以見到明顯的網(wǎng)狀紅色膠原染色(圖1)。

討 論

圖1對照組(A)、精氨酸12 h組(B)、精氨酸7 d組(C)胰腺病理(上)及膠原染色圖(下) (HE、Van Gieson染色 ×100)

簡便易行且重復(fù)性好的CP動(dòng)物模型是進(jìn)行CP相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究的必要條件，也是眾多研究者努力尋求的目標(biāo)。迄今為止，已經(jīng)采用的造模方法包括三硝基苯磺酸胰管內(nèi)注射法、膽總管遠(yuǎn)端結(jié)扎法、油酸胰管內(nèi)注射法、二氯二丁基靜脈注射法、雨蛙素注射法、乙醇灌注法等[2-4]。這些造模方法模擬人類CP發(fā)病因素某個(gè)或多個(gè)環(huán)節(jié)，能夠制作出類似CP病理表現(xiàn)的動(dòng)物模型，部分造模方法被認(rèn)為其誘導(dǎo)CP發(fā)病，符合CP發(fā)病過程，可以用于探討CP發(fā)病機(jī)制和相關(guān)病理生理變化。然而，上述方法普遍造模周期較長，部分方法操作相對困難，穩(wěn)定性不佳。精氨酸法通常用于急性胰腺炎模型制作，我們在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用精氨酸法制作急性胰腺炎模型的大鼠，在造模后第7天，胰腺腺泡組織高度萎縮，伴有小導(dǎo)管增生，管狀復(fù)合結(jié)構(gòu)形成，符合CP組織損傷病理特點(diǎn)，因而試圖探索精氨酸制作CP模型的可行性。本研究結(jié)果顯示，精氨酸注射后7 d，胰腺原有腺胞組織嚴(yán)重破壞，被肉芽組織增生取代，充血，水腫，急慢性漿細(xì)胞浸潤，小導(dǎo)管增生，腺泡明顯減少，并且血淀粉酶水平顯著低于精氨酸12、24 h組，膠原含量較精氨酸12、24 h組顯著增多。

胰腺組織纖維化是CP的主要病理特征之一，是由于細(xì)胞外基質(zhì)合成和降解失衡引起。L-精氨酸導(dǎo)致急性胰腺炎的機(jī)制目前尚未闡明，有人推測氨基酸失衡參與其發(fā)生，另外有研究證實(shí)L-精氨酸誘導(dǎo)急性胰腺炎過程中，有細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)改變，氧自由基、NO和炎性介質(zhì)參與其中，并且存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[5]。各個(gè)因素發(fā)生先后順序及何為始動(dòng)因素尚不知曉，在其共同作用下，胰腺腺泡細(xì)胞在較短時(shí)間內(nèi)大量破壞，同時(shí)伴有大量炎細(xì)胞浸潤。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在隨后1周時(shí)間內(nèi)，胰腺小導(dǎo)管增生，胰腺實(shí)質(zhì)內(nèi)發(fā)生纖維化改變，血淀粉酶含量降低，在一定程度上符合CP病理改變。精氨酸7 d組的病理切片上顯示胰島組織數(shù)量減少，但其血淀粉酶和血糖水平與對照組均無明顯差異，與人類CP臨床表現(xiàn)仍有少許差異。我們設(shè)想，適當(dāng)延長精氨酸造模時(shí)間，或添加輔助誘導(dǎo)劑可能進(jìn)一步完善該模型方法。

[1] Schmidt J,Rattner DW,Lewandrowski K,et al.A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy.Ann Surg,1992,215:44-56.

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[4] 何新紅，陸建平，廖專，等.二丁基二氯化物尾靜脈注射建立大鼠慢性胰腺炎模型.胰腺病學(xué),2007,7:17-20.

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2008-06-30)

(本文編輯：屠振興)

FeasibilitystudyofinductionofexperimentalchronicpancreatitiswithL-arginine

MANXiao-hua,ZHAOHang,XUKe-qun,GONGYan-fang,GAOJun,DUYi-qi,XUAi-fang,LIZhao-shen.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

LIZhao-shen,Email:zhsli@81890.net

ObjectiveTo investigate the feasibility of induction of experimental chronic pancreatitis rat model with L-arginine.MethodsAnimals were randomly divided into control group, arginine 12 h group, arginine 24 h group and arginine 7 d group with 10 rats in each group. L-arginine solution was intraperitoneally injected twice with an interval of 1 h. Serum amylase and glucose levels at corresponding time points were detected and histopathological scores of pancreas were evaluated. Collagen in pancreas was stained with Van Gieson method.ResultsSerum amylase levels were (1 634±890)U/L, (3 872±2 676)U/L, (3 307±2 197)U/L and (1 561±304)U/L in control group, arginine 12 h group, arginine 24 h group and arginine 7 d group, respectively. The serum amylase level in arginine 7 d group was significantly lower than those in arginine 12 h group and arginine 24 h group (Plt;0.05). There was no significant difference in serum glucose level among all the groups. Histopathological scores were 0.8±0.4, 5.1±2.6, 6.5±2.2 and 4.5±1.6, respectively. The histopathological score of arginine 7 d group was significantly lower than those in arginine 24 h group (Plt;0.05). Obvious collagen could be found in pancreatic parenchyma in arginine 7 d group, while little collagen was found in pancreatic tissue in control, arginine 12 h and arginine 24 h groups.ConclusionsInjection of L-arginine induced fibrosis in pancreatic parenchyma and proliferation of tubular complex 7 days later, and it could be used for chronic pancreatitis model induction.

Pancreatitis, chronic; Arginine; Animal, model; Rat

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.02.011

200433 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院消化內(nèi)科(趙航現(xiàn)在上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科)

共同第一作者：趙航

李兆申，Email: zhsli@81890.net