攜帶人Endostatin基因的腺病毒治療胰腺癌移植瘤

呂純業(yè) 胡先貴 張怡杰 劉瑞 金鋼 邵成浩

攜帶人Endostatin基因的腺病毒治療胰腺癌移植瘤

呂純業(yè) 胡先貴 張怡杰 劉瑞 金鋼 邵成浩

目的觀察攜帶人Endostatin基因的重組腺病毒載體Ad-hEnd對裸鼠胰腺癌移植瘤的治療作用。方法將胰腺癌細(xì)胞株SW1990細(xì)胞皮下注射建立裸鼠移植瘤模型，隨機(jī)分為Ad-hEnd組、報(bào)告基因LacZ重組腺病毒組(Ad-LacZ組)和對照組，每組8只。重組腺病毒200 μl瘤內(nèi)注射，隔日1次，共4次。觀察移植瘤的生長情況，免疫組化染色檢測血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá)和微血管密度(MVD)，原位缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測腫瘤細(xì)胞凋亡。結(jié)果移植瘤成瘤率100%。治療后4周，Ad-hEnd組、Ad-LacZ組和對照組移植瘤體積分別為(921.9±279.7)mm3、(2804.4±553.5)mm3和(3040.6±487.6)mm3；瘤重分別為(1.19±0.18)g、(2.38±0.42)g和 (2.41±0.47)g；VEGF表達(dá)陽性率分別為(36.3±7.1)%、(81.2±6.6)%和 (79.4±6.2)%；MVD分別為12±4、27±5和25±6；細(xì)胞凋亡率分別為(31.2±5.4)%、(9.4±4.9)%和(8.5±3.7)%。與Ad-LacZ組和對照組比較，Ad-hEnd組以上各項(xiàng)指標(biāo)均有顯著性差異(Plt;0.01)；Ad-LacZ組和對照組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論重組腺病毒介導(dǎo)的hEndostatin基因可抑制胰腺癌的生長和血管生成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，可用于胰腺癌抗血管生成的基因治療。

胰腺腫瘤； 內(nèi)皮抑素類； 腺病毒； 基因治療

腫瘤的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移均依賴于腫瘤新生血管的形成，因此，抑制腫瘤血管形成可作為腫瘤治療的有效手段。胰腺癌并非是血管豐富的腫瘤，但其發(fā)生發(fā)展仍和血管生成密切相關(guān)。內(nèi)皮抑素(Endostatin)是迄今發(fā)現(xiàn)的作用最強(qiáng)的內(nèi)源性血管生成抑制劑[1]，本實(shí)驗(yàn)在成功構(gòu)建了攜帶人Endostatin (hEndostatin)的重組腺病毒載體基礎(chǔ)上，瘤體內(nèi)注射治療胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型，為利用腺病毒介導(dǎo)的人hEndostatin基因進(jìn)行抗胰腺癌血管生成治療提供依據(jù)。

材料和方法

一、材料

pGEM-T-hEndostantin質(zhì)粒由東方肝膽外科研究所薛惠斌博士構(gòu)建(hEndostatin基因序列前加有M-成瘤蛋白信號(hào)肽，并經(jīng)測序驗(yàn)證正確)，hEndostatin重組腺病毒載體(Ad-hEnd)由我們前期構(gòu)建[2]。AdEasyTM載體系統(tǒng)試劑盒為Stratagene公司產(chǎn)品，BJ5183菌株和293細(xì)胞為腺病毒載體試劑盒所帶，胰腺癌SW1990細(xì)胞系由長海醫(yī)院消化內(nèi)科屠振興教授惠贈(zèng)，DNA 限制性內(nèi)切酶、T4DNA 連接酶為BioLabs公司產(chǎn)品，柱離心式小量膠回收試劑盒、DNA 抽提純化試劑盒為Qiagen公司產(chǎn)品，PCR試劑為上海閃晶生物公司產(chǎn)品，抗血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)一抗為福建邁新公司產(chǎn)品，EnVision免疫組化試劑盒為Daco公司產(chǎn)品。

二、裸鼠皮下移植瘤模型的建立及治療

健康純種SPF級(jí)BALB/C 4周齡雌性裸鼠24只，購自中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。對數(shù)生長期的SW1990細(xì)胞0.2 ml(4×106)注射于裸鼠背部右側(cè)皮下，1周后根據(jù)裸鼠荷瘤體積的大小，按系統(tǒng)抽樣法分為Ad-hEND組、LacZ重組腺病毒(Ad-LacZ)組和對照組，每組8只。5×109pfu/ml的重組腺病毒200 μl，沿腫瘤長徑多點(diǎn)多方向瘤內(nèi)注射，對照組注射等量的PBS，隔日1次，共4次。每周用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑(A)和短徑(B)，腫瘤體積(V)=A×B2×0.52[2]。治療4周后頸椎脫臼法處死裸鼠，切取腫瘤浸入等滲鹽水漂洗干凈，稱重后常規(guī)固定、石蠟包埋、切片。

三、免疫組化染色

常規(guī)性免疫組化染色。鏡檢觀察血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá)和微血管密度(MVD)。VEGF每組動(dòng)物觀察8張切片，每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野(10×40)，計(jì)算VEGF陽性腫瘤細(xì)胞占總細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，取其均值。微血管計(jì)數(shù)采用文獻(xiàn)[3]方法，記錄4個(gè)視野內(nèi)的微血管數(shù)，取其平均數(shù)。

四、原位缺口末端標(biāo)記(TUNEL)法

腫瘤細(xì)胞凋亡采用TUNEL法。每張切片隨機(jī)取3個(gè)陽性視野(10×40)，計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，計(jì)算凋亡細(xì)胞百分率。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、裸鼠皮下移植瘤的生長改變

接種SW1990細(xì)胞1周后，接種部位長出大小約58 mm3的腫瘤，成瘤率100%。各組裸鼠皮下移植瘤均進(jìn)行性增大，但Ad-hEnd組移植瘤生長速度顯著慢于其他2組(圖1，表1)。治療后4周，Ad-hEnd組移植瘤體積為(921.9±279.7)mm3，顯著小于Ad-LacZ組的(2804.4±553.5)mm3和對照組的(3040.6±487.6)mm3(Plt;0.01)；Ad-hEnd組瘤重為(1.19±0.18)g，顯著小于Ad-LacZ組的(2.38±0.42)g和對照組的(2.41±0.47)g (Plt;0.01)。Ad-LacZ組和對照組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)。

圖1 各組裸鼠SW1990細(xì)胞皮下移植瘤的生長曲線

二、移植瘤組織VEGF表達(dá)的變化

各組移植瘤均表達(dá)VEGF(圖2)，Ad-hEnd組移植瘤VEGF表達(dá)陽性率為(36.3±7.1)%，顯著低于Ad-LacZ組的(81.2±6.6)%和對照組的(79.4±6.2)%(Plt;0.01)；Ad-LacZ組和對照組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)。

三、移植瘤MVD的變化

Ad-hEnd組移植瘤MVD為12±4，明顯少于Ad-LacZ組的27±5和對照組的25±6(Plt;0.01)；Ad-LacZ組和對照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)。

四、移植瘤細(xì)胞凋亡率的變化

Ad-hEnd組移植瘤細(xì)胞凋亡明顯增多，呈簇狀分布，而Ad-LacZ組、對照組僅有散在分布的凋亡細(xì)胞(圖3)。Ad-hEnd組移植瘤細(xì)胞凋亡率為(31.2±5.4)%，明顯高于Ad-LacZ組的(9.4±4.9)%和對照組的(8.5±3.7)%(Plt;0.01)；Ad-LacZ組和對照組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)。

表1 各組裸鼠SW1990細(xì)胞皮下移植瘤的體積和重量的變化

注：與其他2組比較，*Plt;0.01

圖3 Ad-hEnd組(A)、Ad-LacZ組(B)和對照組(C)腫瘤的凋亡細(xì)胞(TENEL ×400)

討 論

血管形成是惡性腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，因此惡性腫瘤的治療應(yīng)針對兩個(gè)不同的細(xì)胞群體：腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞。Endostatin是O′Reilly等于1997年從小鼠內(nèi)皮瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中首次分離出來的，由膠原ⅩⅧ C末端單基因片斷編碼的184個(gè)氨基酸組成，是迄今發(fā)現(xiàn)的作用最強(qiáng)的內(nèi)源性血管抑制因子，其重組蛋白已用于臨床，但由于生產(chǎn)費(fèi)用昂貴、需長期全身用藥、治療劑量大、操作復(fù)雜及可能產(chǎn)生不良反應(yīng)等缺點(diǎn)，目前尚不能普及。Endostatin局部給藥療效優(yōu)于全身給藥[3]，若采用基因治療的方式將目的基因轉(zhuǎn)入腫瘤組織，使其可自分泌和(或)旁分泌血管抑制因子，不僅降低成本，還可在腫瘤局部造成藥物的高濃度，增強(qiáng)治療效果。

胰腺癌的血管生成也是血管調(diào)控因子失衡的結(jié)果[4]，可作為胰腺癌分化、轉(zhuǎn)移和預(yù)后分析的指標(biāo)[5]。下調(diào)腫瘤細(xì)胞內(nèi)源性VEGF的表達(dá)是Endostatin抗腫瘤的機(jī)制之一[6-7]，導(dǎo)入外源基因上調(diào)內(nèi)源性血管生成抑制因子的表達(dá)以拮抗VEGF的促進(jìn)血管生成作用，能顯著抑制胰腺癌的生長和轉(zhuǎn)移。由于Endostatin抑制血管生成以及腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移均表現(xiàn)出明顯的量-效依賴關(guān)系，因而有效的基因轉(zhuǎn)移方法和轉(zhuǎn)移基因的高效表達(dá)是Endostatin基因治療的關(guān)鍵。質(zhì)粒、脂質(zhì)體等介導(dǎo)的Endostatin基因治療雖然在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中抑制了腫瘤生長，但由于轉(zhuǎn)染效率不高，抑瘤效應(yīng)比Endostatin重組蛋白要弱，而應(yīng)用高效的病毒載體介導(dǎo)Endostatin基因轉(zhuǎn)移的治療效果顯著優(yōu)于重組蛋白[8]。

我們在前期研究中成功構(gòu)建了攜帶人Endostatin的重組腺病毒載體(Ad-hEnd)，Western blotting分析證實(shí)目的基因可在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，所表達(dá)的hEndostatin蛋白顯著抑制雞胚尿囊膜血管生成，具有生物學(xué)活性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，將Ad-hEnd注入胰腺癌移植瘤后顯著抑制其生長，抑瘤率達(dá)54.14%，同時(shí)移植瘤組織中VEGF的表達(dá)下降，MVD減少，腫瘤細(xì)胞凋亡率增加，表明靶向Endstatin的基因治療有一定療效。但轉(zhuǎn)染hEndostatin基因并不能完全抑制移植瘤生長，原因可能在于腫瘤血管形成受多種促進(jìn)因子和抑制因子共同調(diào)節(jié)，胰腺癌細(xì)胞本身也能產(chǎn)生多種血管生成促進(jìn)因子，hEndostatin基因轉(zhuǎn)染難以完全拮抗其作用。有研究證實(shí)Endostatin能增強(qiáng)肺癌的化療效果[9]，對化療不敏感的胰腺癌是否具有相同的作用尚有待繼續(xù)研究。

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[2] 呂純業(yè)，胡先貴，邵成浩，等.重組腺病毒介導(dǎo)的人內(nèi)皮抑素基因在SW1990細(xì)胞中的表達(dá).中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2007，24：1220-1222.

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2008-08-21)

(本文編輯：屠振興)

Humanendostatingenerecombinantadenovirusforpancreaticcarcinomainnudemice

LVChun-ye,HUXian-gui,ZHANGYi-jie,LIURui,JINGang,SHAOCheng-hao.

DepartmentofGeneralSurgery,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

SHAOCheng-hao,Email:schhao@133sh.com

ObjectiveTo construct a human endostatin adenovirus vector and investigate its inhibitory effect on pancreatic carcinoma in nude mice.MethodsAnimal model of pancreatic carcinoma bearing nude mice was established by subcutaneous injection of SW1990 cells. All mice were randomized into Ad-hEnd group, Ad-LacZ group and control group with 8 mice in each group. The endostatin gene recombinant adenovirus were intratumorally injected every two days for 4 times. The rate of tumor growth was observed. Immunohistochemical staining was employed to investigate the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and micro-vessel density (MVD). TUNEL in situ was used to examine tumor cell apoptosis.ResultsThe tumor formation rate was 100%. 4 weeks later, the volumes of the tumors were (921.9±279.7)mm3, (2804.4±553.5)mm3and (3040.6±487.6)mm3in Ad-hEnd group, Ad-LacZ group and control group, respectively; the weights of the tumors were (1.19±0.18)g, (2.38±0.42)g and (2.41±0.47)g, respectively; the VEGF positive rates were (36.3±7.1)%, (81.2±6.6)% and (79.4±6.2)%, respectively; the levels of MVD were 12±4, 27±5 and 25±6, respectively; the apoptotic rates were (31.2±5.4)%, (9.4±4.9)% and (8.5±3.7)%, respectively. Compared with Ad-LacZ group and control group, the parameters in Ad-hEnd group were statistically different (Plt;0.01). The difference between Ad-LacZ group and control group was not statistically different.ConclusionsHuman endostatin gene mediated by recombinant adenovirus could inhibit tumor growth, angiogenesis and promote cell apoptosis of pancreatic carcinoma and could be used as gene therapy for pancreatic carcinoma.

Pancreatic neoplasms; Endostatins; Adenoviruses; Gene therapy

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.02.007

國家自然科學(xué)基金(30200275)；上海市青年科技啟明星計(jì)劃(05QMX1472)

200433 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院普外科

邵成浩，Email: schhao@133sh.com