干細(xì)胞因子在胰腺星狀細(xì)胞和肥大細(xì)胞黏附中的作用

吳愷 徐剛 徐銘益 王興鵬

·論著·

干細(xì)胞因子在胰腺星狀細(xì)胞和肥大細(xì)胞黏附中的作用

吳愷 徐剛 徐銘益 王興鵬

目的觀察干細(xì)胞因子(SCF)在活化胰腺星狀細(xì)胞(PSC)中的表達(dá)以及在PSC與肥大細(xì)胞黏附中的作用。方法采用SD大鼠胰腺組織塊培養(yǎng)分離活化PSC，應(yīng)用RT-PCR免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)PSC的SCF mRNA和蛋白的表達(dá)；經(jīng)不同劑量的抗SCF抗體中和PSC表面SCF，采用β-氨基已糖苷酶測(cè)定觀察肥大細(xì)胞與PSC之間的黏附；PSC經(jīng)10 μg/ml絲裂霉素C處理后為飼養(yǎng)層細(xì)胞，與肥大細(xì)胞共培養(yǎng)，硫堇蘭染色觀察培養(yǎng)后2、3、5 d的肥大細(xì)胞生長(zhǎng)情況。結(jié)果活化的PSC表達(dá)SCF mRNA和蛋白。對(duì)照組、1 mg/ml 和10 mg/ml抗體處理組黏附的肥大細(xì)胞量分別為每視野(48±10)個(gè)、(28±8)個(gè)和(23±9)個(gè)，抗體組較對(duì)照組明顯減少(Plt;0.05)。1 mg/ml 和10 mg/ml抗體組的肥大細(xì)胞黏附率分別為(53±3)%和(45±5)%。PSC和肥大細(xì)胞在無(wú)血清條件下共培養(yǎng)1 d后，PSC有肥大細(xì)胞黏附；共培養(yǎng)3 d后黏附的數(shù)量增加；5 d后呈堆積狀，有較多集落形成，PSC基本消失。結(jié)論活化的PSC可合成分泌SCF，引起肥大細(xì)胞的黏附和生長(zhǎng)。

干細(xì)胞因子； 胰腺； 星形細(xì)胞； 肥大細(xì)胞

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),肥大細(xì)胞不僅是Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)的主要免疫細(xì)胞，還參與慢性炎癥及纖維化的過(guò)程。在慢性胰腺炎胰腺纖維化組織中有胰腺星狀細(xì)胞(pancreatic stellate cell，PSC)的活化，同時(shí)肥大細(xì)胞數(shù)量明顯增加，并表現(xiàn)為特征性慢性脫顆粒[1]，但在胰腺纖維化過(guò)程中活化的PSC是否參與肥大細(xì)胞的趨化及生長(zhǎng)尚不明了。干細(xì)胞因子(stem cell factor，SCF)是肥大細(xì)胞趨化和生長(zhǎng)的必需因子。因此，本實(shí)驗(yàn)觀察活化的PSC中SCF的表達(dá)以及對(duì)肥大細(xì)胞黏附和生長(zhǎng)的影響。

材料與方法

一、肥大細(xì)胞

肥大細(xì)胞株(RBL-2H3)由本院檢驗(yàn)科李莉主任惠贈(zèng)，培養(yǎng)于含10%小牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco公司)，每3 d傳代一次。

二、胰腺星狀細(xì)胞分離

雄性SD大鼠，購(gòu)自中科院動(dòng)物中心，體重300 g左右。無(wú)菌條件下取胰腺組織，滅菌D-Hanks溶液漂洗去除血液后，剪成約1 mm3的小塊，平鋪于塑料培養(yǎng)皿中，先后滴加無(wú)菌大鼠血漿及氯化鈣，形成纖維包裹層，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2孵育培養(yǎng)，每2 d更換培養(yǎng)液。2 d后見(jiàn)組織塊周?chē)蠵SCs移出，待PSC達(dá)到一定數(shù)量后剔除組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，胰酶消化傳代，3～6代PSC用于實(shí)驗(yàn)。

三、SCF蛋白表達(dá)的檢測(cè)

采用細(xì)胞免疫化學(xué)法。PSC接種于玻璃爬片，常規(guī)培養(yǎng)24 h，取出后用冰冷無(wú)水甲醇固定20 min，PBS洗滌后滴加兔抗大鼠SCF多克隆抗體(1∶100，購(gòu)自武漢博士德生物公司)4℃過(guò)夜，PBS洗滌后滴加即用型HRP標(biāo)記二抗(長(zhǎng)島生物技術(shù)公司)室溫孵育30 min，PBS洗滌后DAB顯色，蘇木素復(fù)染后中性樹(shù)膠封片。胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性。

四、SCF mRNA的檢測(cè)

采用RT-PCR方法。收集PSC細(xì)胞，采用Trizol試劑盒抽提細(xì)胞總RNA，SCF引物序列為5′-GCT-ACCCAATGCTGGGACTA-3′和5′-GCCACGAGGTCA-TCCACTAT-3′，退火溫度為56℃，擴(kuò)增片段為456 bp，以GAPDH為內(nèi)參照。擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后采用GeneGenius凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察分析。

五、肥大細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)

PSC接種于96孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后充分洗滌，添加含1、10 mg/ml的SCF IgG的無(wú)血清培養(yǎng)基，對(duì)照組加入非免疫型IgG，每個(gè)濃度重復(fù)4孔。培養(yǎng)3 h后棄去培養(yǎng)基，每孔加入1×104肥大細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，然后用無(wú)血清培養(yǎng)基輕輕洗滌3次，去除未黏附的肥大細(xì)胞。隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)PSC細(xì)胞表面黏附的肥大細(xì)胞數(shù)量。

六、β-氨基己糖苷酶(β-hexasaminidase)測(cè)定

β-氨基己糖苷酶是肥大細(xì)胞中特有的酶類(lèi)，其活性的高低反映肥大細(xì)胞的數(shù)量以及顆粒分泌的情況。參考文獻(xiàn)[2]方法檢測(cè)。同上述黏附實(shí)驗(yàn)操作，以單純1×104肥大細(xì)胞作對(duì)照。用100 μl細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，吸取25 μl細(xì)胞裂解液和100 μl 1.2 mmol/L的4-methyllumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminidase(溶于0.05 mol/L醋酸鈉溶液，pH4.4)于96孔板，37℃反應(yīng)30 min，加入175 μl 0.1 mol/L甘氨酸-碳酸鹽緩沖液(pH10.0)，混勻后在熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)。激發(fā)波長(zhǎng)為360 nm，淬滅波長(zhǎng)為450 nm。肥大細(xì)胞黏附率=樣品管A值/對(duì)照組A值×100%。

七、PSC對(duì)肥大細(xì)胞生長(zhǎng)影響的觀察

PSC接種于24孔培養(yǎng)板，待70%～80%細(xì)胞融合時(shí)加入10 μg/ml的絲裂霉素C，37℃孵育3 h，用PBS洗滌細(xì)胞6次充分洗去絲裂霉素C，制備PSC飼養(yǎng)層細(xì)胞。培養(yǎng)24 h后加入2×104肥大細(xì)胞，采用無(wú)血清化培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)后第2、3、5天用硫堇蘭染色，觀察肥大細(xì)胞(呈紫紅色)的生長(zhǎng)情況。

八、統(tǒng)計(jì)分析

結(jié) 果

一、活化PSC的SCF mRNA和蛋白的表達(dá)

分離培養(yǎng)的活化PSC細(xì)胞呈梭形，活化的PSC表達(dá)SCF mRNA和蛋白(圖1)。

圖1活化PSCs的SCF mRNA(A )和蛋白(B，免疫化學(xué)染色 ×200)表達(dá)

二、PSC和肥大細(xì)胞之間的黏附

鏡下肥大細(xì)胞呈圓形或橢圓形，散在黏附于PSC表面，對(duì)照組和1 mg/ml、10 mg/ml抗體組黏附的肥大細(xì)胞量分別為每視野(48±10)個(gè)、(28±8)個(gè)和(23±9)個(gè)，抗體組較對(duì)照組明顯減少(Plt;0.05)。β-氨基已糖苷糖酶測(cè)定的肥大細(xì)胞黏附率，1、10 mg/ml抗體組分別為(53±3)%、和(45±5)%。

三、PSC對(duì)肥大細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

肥大細(xì)胞在無(wú)血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 d后有大量細(xì)胞漂浮，只能維持存活2 d。經(jīng)絲裂霉素C處理后的PSC飼養(yǎng)層細(xì)胞，具有無(wú)法增殖、可維持細(xì)胞正常生理活性等特點(diǎn)，并在5～7 d后死亡消失。PSC和肥大細(xì)胞在無(wú)血清條件下共培養(yǎng)1 d后，PSC有肥大細(xì)胞黏附存活，培養(yǎng)液中有肥大細(xì)胞懸浮；3 d后黏附的肥大細(xì)胞數(shù)量增加，而PSC和懸浮的肥大細(xì)胞數(shù)量減少；5 d后肥大細(xì)胞呈堆積狀，有較多集落形成，PSC基本消失，僅有零星散在分布(圖2)。

圖2PSC和肥大細(xì)胞共培養(yǎng)1(A)、3(B)、5 d(C)的細(xì)胞生長(zhǎng)情況(×100)

討 論

近年研究發(fā)現(xiàn)，肥大細(xì)胞不僅參與局部的免疫反應(yīng)，在慢性炎癥及組織纖維化中也發(fā)揮一定的作用，其顆粒成分諸如類(lèi)胰蛋白酶(tryptase)、類(lèi)糜蛋白酶(chymase)及肝素等均可刺激成纖維細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞膠原合成增加，在肝臟、腎臟等組織纖維化中均有肥大細(xì)胞數(shù)量的增加且與纖維化程度呈正相關(guān)[3-4]。胰腺纖維化過(guò)程中主要效應(yīng)細(xì)胞PSC的持續(xù)活化增殖是關(guān)鍵。在胰腺纖維化組織中有肥大細(xì)胞的聚集和慢性脫顆粒，且主要分布在PSC周?chē)?，推測(cè)活化的PSC可能參與了肥大細(xì)胞的聚集和脫顆粒過(guò)程。

肥大細(xì)胞來(lái)源于骨髓，在外周血發(fā)育成熟并分布于臟器的間質(zhì)中，數(shù)量和分布相對(duì)穩(wěn)定。SCF是肥大細(xì)胞發(fā)育成熟以及組織趨化定位的主要介質(zhì)，通過(guò)與肥大細(xì)胞表面的SCF受體(c-kit)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，SCF分為可溶性和膜結(jié)合型兩大類(lèi)，可溶性SCF主要影響肥大細(xì)胞的成熟及趨化，而膜結(jié)合型參與細(xì)胞之間的黏附接觸。此外，肥大細(xì)胞胞膜表面有特異性生精免疫球蛋白超級(jí)家族(spermatogenic immunoglobulin superfamily, SgIGSF)表達(dá)。不表達(dá)c-Kit和SgIGSF的肥大細(xì)胞株IC-2轉(zhuǎn)染c-Kit和SgIGSF基因后，其與成纖維細(xì)胞的黏附量明顯高于單獨(dú)轉(zhuǎn)染c-Kit基因的細(xì)胞，而單獨(dú)轉(zhuǎn)染SgIGSF基因則黏附作用未見(jiàn)增強(qiáng)，提示SCF/c-Kit可能是肥大細(xì)胞黏附作用的主要啟動(dòng)因素，對(duì)其他參與因素具有引導(dǎo)作用[5]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，活化的PSC表達(dá)SCF mRNA和蛋白，經(jīng)抗SCF抗體中和后，肥大細(xì)胞黏附于PSC的數(shù)量明顯減少，在1 μg/ml以上抗體中和后，肥大細(xì)胞的黏附率維持在50%左右，呈現(xiàn)一個(gè)平臺(tái)期，提示除SCF/c-Kit系統(tǒng)外還存在其他黏附分子參與細(xì)胞間的黏附過(guò)程。

SCF對(duì)肥大細(xì)胞的生長(zhǎng)具有重要意義。原代肥大細(xì)胞體外培養(yǎng)條件下無(wú)法長(zhǎng)期存活，然而在SCF和IL-1持續(xù)刺激下可存活2～3周。Sellge等[6]在人腸道原代成纖維細(xì)胞(FB)和原代肥大細(xì)胞的共培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)，肥大細(xì)胞在FB存在的條件下可存活至3周，遠(yuǎn)長(zhǎng)于肥大細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)條件下的3～4 d的存活時(shí)間，推測(cè)肥大細(xì)胞釋放的顆粒成分作用于FB產(chǎn)生SCF，SCF刺激肥大細(xì)胞的生長(zhǎng)，形成相互刺激作用。本研究采用絲裂霉素C抑制PSC的生長(zhǎng)，制備成飼養(yǎng)細(xì)胞，與肥大細(xì)胞共培養(yǎng)后，肥大細(xì)胞黏附于PSC并生長(zhǎng)，推測(cè)胰腺纖維化過(guò)程中活化PSC表達(dá)的SCF誘導(dǎo)肥大細(xì)胞趨化黏附并生長(zhǎng)，而肥大細(xì)胞的顆粒成分維持PSC的活化，加速纖維化的形成。

[1] 吳愷，張汝玲，王興鵬.肥大細(xì)胞在胰腺纖維化中的介導(dǎo)作用.胰腺病學(xué),2003,3:129-131.

[2] Naal RM, Tabb J,Holowka D,et al.In situ measurement of degranulation as a biosensor based on RBL-2H3 mast cells. Biosen Bioelectron,2004,20:791-796.

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2008-12-01)

(本文編輯：呂芳萍)

Effectofonadhesionbetweenpancreaticstellatecellandmastcell

WU Kai, XU Gang, XU Ming-yi, WANG Xing-peng.

Department of Gastroenterology, Shanghai First People′s Hospital, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200080, China

WANGXing-peng,Emailwangxp1965@yahoo.com.cn

ObjectiveTo investigate stem cell factor (SCF) expression in activated pancreatic stellate cell (PSC) and the effect of SCF on adhesion between PSC and mast cell (MC).MethodsPSC of SD rat was separated and activated by pancreatic tissue culture; the expression of SCF mRNA and protein was detected by RT-PCR and immunochemistry. SCF was blocked with different dose of anti-SCF antibody, the rate of adhesion between PSC and MC was determined by thionin blue stain and β-hexasaminidase assay. PSC was stimulated by 10 μg/ml mitomycin-C and was co-cultured with MC, then the growth of MC was observed at 2, 3, 5 day, respectively.ResultsActivated PSC expressed SCF mRNA and protein, the number of adhered MC in the control, 1 mg/ml and 10 mg/ml antibody groups was 48±10, 28±8, and 23±9, respectively; the difference between antibody and control group was statistically significant (Plt;0.05). One day after PSC and MC was co-cultured without serum, there were MC adhesion; 3 days later the rate of adhesion increased; 5 days later the adhesion appeared bulk-like and lots of colonies were present, while PSC basically disappeared.ConclusionsActivated PSC may synthesize, express SCF and induced adhesion and growth of MC.

Stem cell factor; Pancreas； Astrocytesl; Mast cells

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.05.010

上海市衛(wèi)生局課題資助(024016)

200080 上海，上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院消化科(吳愷、徐剛、徐銘益、王興鵬)；同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院(王興鵬)

王興鵬，Email: wangxp1965@yahoo.com.cn