人胰腺癌細胞株PANC1裸鼠原位模型的建立及磁共振監(jiān)測

何偉 王冬青 孫維斌 蘇兆亮 王錚超 許云飛

·論著·

人胰腺癌細胞株PANC1裸鼠原位模型的建立及磁共振監(jiān)測

何偉 王冬青 孫維斌 蘇兆亮 王錚超 許云飛

目的建立一種穩(wěn)定的人胰腺癌裸小鼠原位移植瘤模型，并探討無創(chuàng)的磁共振(MRI)對其監(jiān)測的應用價值。方法人胰腺癌細胞株PANC1體外常規(guī)傳代后建立裸鼠皮下種植瘤模型，將皮下種植瘤制成細胞懸液，植入20只BALB/C-nu裸鼠的胰腺包膜下構建人胰腺癌原位移植模型；通過MRI檢查監(jiān)測模型的成瘤率、成瘤時間、腫瘤生長速度、腫瘤形態(tài)、信號變化等特征，于第7周末取腫瘤組織行病理學檢查。結果接種后15 d，7只(35%)荷瘤鼠在MRI上顯示成瘤，至接種后27 d，成瘤率為100%。腫瘤信號與鄰近組織相比，90%(18/20)病灶T1WI呈均勻稍低信號，10%(2/20)呈等信號；75%(15/20)在T2WI呈均勻高信號。移植后2、3、4、5、6、7周經(jīng)MRI測量的移植瘤體積分別為(12.6±2.4)mm3、(94.3±11.2)mm3、(175.9±82.5)mm3、(395.8±126.6)mm3、(1290.2±167.2)mm3、(1583.4±87.4)mm3。病理學檢查確診為胰腺低分化腺癌，并保持原發(fā)瘤的生物學特征。結論人胰腺癌細胞株PANC1移植瘤制成的細胞懸液種植裸小鼠胰腺包膜下制備胰腺癌模型符合人胰腺癌的特征，且易于無創(chuàng)監(jiān)測，為臨床研究提供了一個有效、穩(wěn)定的體內(nèi)實驗體系。

胰腺腫瘤； 磁共振成像； 小鼠，裸； 腫瘤細胞系

早期發(fā)現(xiàn)并手術切除腫瘤是提高生存率的關鍵[1-3]，但臨床上很難完整觀察及研究胰腺癌的發(fā)生發(fā)展過程。本實驗在裸鼠胰腺包膜下注入人胰腺癌細胞株PANC1懸液，旨在建立人胰腺癌裸小鼠胰腺原位移植瘤模型，為胰腺癌的臨床研究提供一個易于復制及便于監(jiān)測的腫瘤體內(nèi)實驗系統(tǒng)。

材料和方法

一、細胞培養(yǎng)與裸鼠皮下瘤模型的建立

人胰腺癌細胞株PANC1購自中國科學院上海生物科學研究所，體外常規(guī)傳代。BALB/C-nu裸小鼠25只，購自揚州大學農(nóng)學院動物實驗中心，雌性，4～6周齡，體重16～20 g，SPF級分籠飼養(yǎng)。其中5只裸鼠右肩部皮下種植PANC1細胞懸液建立皮下種植瘤模型。取一只腫瘤生長較快的荷瘤鼠，在無菌條件下摘取皮下種植瘤研磨制成1×108/ml的細胞懸液。取50 μl細胞懸液注入胰尾下，在超凈臺內(nèi)20只裸鼠的胰腺包膜下。共移植。嚴格無菌。術后自由進食飲水。

術后每日記錄裸鼠的一般狀況、手術并發(fā)癥，稱體重，肉眼觀察并觸診腫瘤的生長狀況。

二、磁共振動態(tài)檢查

應用Siemens Magnetom Trio Tim 3.0T超導磁共振成像儀，使用臨床型乳腺線圈，對所有裸鼠術前行常規(guī)磁共振(MRI)檢查，術后第3天行MRI TSE序列T1WI、T2WI橫斷面、冠狀面及矢狀面掃描，掃描參數(shù)見表1。增強掃描采用TSE-T1WI-FS序列，此后每隔3 d復查一次，直至第7周處死裸鼠。由三位影像科醫(yī)師分別觀察并記錄腫瘤的部位、大小、形態(tài)、腫瘤信號及浸潤、轉移等。在T2WI測量腫瘤的最大長徑(L)、寬徑(W)和高徑(H)，按下列公式計算腫瘤體積V(mm3)。V=(4/3×π×L×W×H)×1/8[3]。

三、裸鼠原位瘤模型的病理學診斷

收集腫瘤原發(fā)灶及所有可能發(fā)生侵襲、轉移的臟器，用10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，以4 μm厚度連續(xù)切片，行HE染色，常規(guī)光鏡檢查。

結 果

一、原位移植后荷瘤鼠瘤體生長狀況

20只荷瘤鼠在2周內(nèi)進食、進水正常；3周后出現(xiàn)納差，活動力減弱；5周后逐漸出現(xiàn)消瘦、皮膚干燥、惡病質(zhì)等生物學特性。接種后27 d 2只荷瘤鼠意外死亡。接種后第3天，處死2只荷瘤鼠觀察移植瘤的生長。移植后荷瘤鼠1、2、3、4、5、6、7周的平均體重分別為19.7、20.1、20.0、19.2、18.9、18.5、17.6 g。

二、荷瘤鼠的MRI掃描所見

制模后第3天， MRI均顯示陰性結果。至15 d，7只(35%)荷瘤鼠的MRI顯示左腎前上方異常信號，病灶呈不規(guī)則形，境界清晰，最小瘤灶約2 mm×3 mm×4 mm。與周圍組織相比，T1WI呈不均勻稍低信號，T2WI呈均勻高信號(圖1A)，處死的2只荷瘤鼠的胰尾處形成不規(guī)則白色結節(jié)，質(zhì)地較硬，無轉移灶。移植后27 d，MRI均顯示胰腺腫瘤，接種成功率為100%。腫瘤信號與鄰近組織相比，90%(18/20)T1WI呈均勻稍低信號，10%(2/20)呈等信號；75%(15/20)在T2WI呈均勻高信號，10%(2/20)以高信號為主，15%(3/20)呈等低信號；增強掃描瘤灶邊緣強化，中央不強化或輕度不均勻強化(圖1B、C)。移植后2、3、4、5、6、7周的瘤體積分別為(12.6±2.4) mm3、(94.3±11.2) mm3、(175.9±82.5) mm3、(395.8±126.6) mm3、(1290.2±167.2) mm3、(1583.4 ±87.4) mm3，中后期生長較快。

表1 荷瘤裸鼠MRI平掃序列和參數(shù)

圖1同一動物模型在癌細胞移植后15(A)、27 d(B)的MRI平掃和27 d增強掃描(C)的表現(xiàn)

三、荷瘤鼠的病理學檢查

術后27 d死亡的荷瘤鼠的胰腺腫瘤呈類圓形、分葉狀或結節(jié)狀，質(zhì)較硬，表面血管分布較少，瘤灶與周圍組織粘連，中心部位出現(xiàn)點狀壞死腔(圖2A)。術后7周荷瘤鼠的腫瘤體積明顯增大，鄰近器官有轉移及浸潤，未見明顯腹水。其中2只腹膜上有多個白色小結節(jié)形成，直徑在2～5 mm。

鏡下見腫瘤細胞排列成實性巢片狀結節(jié)，無腺腔，周圍可見正常胰腺細胞。后期瘤灶腫瘤細胞層數(shù)少，中央可見大片狀壞死；腫瘤細胞形態(tài)不一，呈多邊形或柱形，邊界清楚，胞質(zhì)淡染，胞核大而圓，染色深，異型性明顯，可見巨核、雙核，甚至奇異形核及病理性核分裂像，符合胰腺低分化腺癌(圖2B)。

圖2原位移植瘤大體表現(xiàn)(A)及病理變化(B,HE ×200)

討 論

評價一種模型主要根據(jù)它對人類疾病的生物學特征的復制程度[4]。人胰腺癌細胞株PANC1為惡性低分化腺癌，通過裸鼠皮下移植型、脾內(nèi)注射和原位移植為常用的動物模型[5]。皮下接種簡單易行，但移植瘤的生物學特性常同原發(fā)灶不同，如移植瘤常有包膜、呈局限性生長、很少發(fā)生局部或遠處器官的轉移等，且由于受到位置的影響, 可能會產(chǎn)生藥物療效的假陽性結果。脾內(nèi)注射胰腺癌細胞所致的動物模型本質(zhì)上并非原位,而是異地發(fā)育或旁路侵襲，以上兩種模型均未能如實反映人胰腺癌形態(tài)及生物學特性。原位移植是將體外培養(yǎng)的胰腺癌細胞或者外科手術中采集的胰腺癌組織移植到裸鼠的胰腺部位，能最大程度地表現(xiàn)和腫瘤轉移能力密切相關的細胞特性。異種原位移植最常用的途徑有瘤細胞懸液原位注射以及外科原位種植技術(SOI技術)，即采用直接來自新鮮外科標本或移植的人腫瘤組織, 通過原位種植于裸鼠體內(nèi)建立腫瘤模型，SOI技術在胃、肝臟及肺的原位腫瘤模型建立中應用較多[6]，但由于其對外科技術要求高，在胰腺包膜下嵌插組織塊難度大，極易造成胰腺組織穿透、出血、胰漏以及組織塊脫落，引起嚴重的手術并發(fā)癥，造成裸鼠死亡或其它部位的種植。我們曾嘗試使用原位種植方法建立模型，因組織塊脫落，導致實驗失敗。后改用細胞懸液移植于裸鼠胰腺包膜下，在腫瘤細胞植入后15 d即可通過MRI無創(chuàng)監(jiān)測到腫瘤的形成，至第27天MRI顯示成瘤率為100%，與Zervox等[7]研究基本一致。移植后7周腫瘤的病理分析顯示腫瘤細胞的形態(tài)、惡性生物學行為以及影像學表現(xiàn)均符合典型的人胰腺癌特征。同時，本實驗還嘗試在現(xiàn)有條件下使用高場強磁共振及臨床型線圈對腫瘤的生長進行無創(chuàng)監(jiān)測[8]，是一種敏感、可靠的檢測手段。本實驗方法為更深入地研究胰腺癌發(fā)病機制、尋求新的治療手段、篩選新型抗腫瘤藥物等體內(nèi)實驗研究提供了較理想的荷瘤裸鼠模型與觀察方法。

[1] 李曉兵．早期胰腺癌的CT和MRI診斷．國外醫(yī)學·臨床放射學分冊，2002，25:97 -100．

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[4] 吳深寶，周國雄，黃介飛，等．實驗性胰腺癌動物模型研究進展，胰腺病學，2005，5：187-189.

[5] 王虹，彭衛(wèi)斌，許云飛，等．人胰腺癌裸鼠模型3,0 T MRI早期表現(xiàn)．臨床放射學雜志．2008，27：957-960．

[6] Teresa Troiani，Clorinda Schettino，Erika Martinelli，et al．The use of xenograft models for the selection of cancer treatments with the EGFR as an example．Criti Rev Onco Hematolo,2008,65:200-211．

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2009-02-12)

(本文編輯：屠振興)

EstablishmentandmagneticresonanceimagingmonitoringoftheorthotopictransplantationnudemousemodelwithhumanpancreaticcancercelllinePANC1

HE Wei, WANG Dong-qing, SUN Wei-bin, SU Zhao-liang, WANG Zheng-chao, XU Yun-fei.

Department of Radiology, Affiliated Hospital, Medical School, Jiangsu University, Zhenjiang 212001, China

WANGDong-qing,Emailwangdongqing71@hotmail.com

ObjectiveTo establish a stable orthotopic transplantation nude mouse model of the human pancreatic cancer and to explore the role of monitoring tumor growth with noninvasive MRI.MethodsThe tumors cells suspension made by the subcutaneous injection of human pancreatic cancer cell lines PANC1 were used as the source of tissue for orthotopic implantation of tissue,and transplanted into the pancreas of 20 BALB/C- nu nude mice. After implantation, the successful rate, tumor formation time, tumor growth speed, tumor shape and the change of signal of the tumor were monitored and recorded noninvasively by MRI. At the end of the 7th week, all the specimens were examined by pathological methods.ResultsThirty-five percent (7/20) mice with implantation of primary human PANC1 adenocarcinoma cells were detected to have orthotopic implanted tumors by MRI after 15 days, and all the 20 nude mice developed pancreatic tumor within 27 days after operations, and the successful rate was 100%. Compared with adjacent normal tissue, the T1WI imaging of 90% (18/20) of all the tumors showed uniformly hypo-intense signal, 10%(2/20) showed iso-intense signal, the T2W 75% (15/20) showed uniformly hyper-intense signal. The tumor size 2, 3, 4, 5, 6, 7 weeks after implantation was (912.6±2.4)mm3, (94.3±11.2)mm3, (175.9±82.5)mm3, (395.8±126.6)mm3, (1290.2±167.2)mm3, (1583.4±87.4)mm3, respectively. Pathologic examination confirmed poorly differentiated pancreatic adenocarcinoma and it remained the primary tumor′s biologic features.ConclusionsThe orthotopic transplantation nude mouse model was in accordance with the feature of human pancreatic cancer and was easy for noninvasive monitoring, which provided an effective and stable in vivo experimental system.

Pancreatic neoplasm; Magnetic resonance imaging; Mice, nude; Tumor cell line

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.05.013

江蘇省自然科學基金(BK2006080)

212001 鎮(zhèn)江，江蘇大學附屬醫(yī)院影像科 江蘇大學臨床醫(yī)學院影像系

王冬青，Email:wangdongqing71@hotmail.com