天麻小菇屬萌發(fā)菌生產(chǎn)技術(shù)

陳順方　祁　岑　黃先敏

摘要簡(jiǎn)要介紹了萌發(fā)菌的生活特性,并從菌種分離、鑒定、培養(yǎng)等方面介紹了萌發(fā)菌的生產(chǎn)技術(shù),以指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)。

關(guān)鍵詞天麻;萌發(fā)菌;生產(chǎn)技術(shù)

中圖分類號(hào)Q949.32文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼B文章編號(hào) 1007-5739(2009)15-0110-01

天麻又名神草、仙仙根、定風(fēng)草、離合草、仙人腳、鬼督郵、還筒子、赤箭、離母、四龍子、鬼箭桿、盜人腳、山蘿卜、水洋芋,其地下球莖是我國(guó)名貴的傳統(tǒng)中藥。蘭科天麻屬,多年生草本植物,無根、無綠色葉片,在其生活史中大部分時(shí)間在地下度過,既不能從土壤中吸收無機(jī)礦物元素,也不能進(jìn)行光合作用自養(yǎng)生活,其生長(zhǎng)發(fā)育所需營(yíng)養(yǎng)主要依靠同化侵入其體內(nèi)的一些真菌而獲得。種子需要同化小菇屬等真菌才能獲得營(yíng)養(yǎng)而發(fā)芽,發(fā)芽后形成的球莖又必須同化蜜環(huán)菌才能正常生長(zhǎng)發(fā)育形成成體球莖(箭麻)[1]。從目前已用于生產(chǎn)的萌發(fā)菌看,萌發(fā)菌為弱腐生菌,培養(yǎng)條件苛刻、技術(shù)要求較高,一般由專業(yè)生產(chǎn)廠提供?，F(xiàn)將萌發(fā)菌生產(chǎn)技術(shù)介紹如下。

1生活特性

到目前為止,文獻(xiàn)報(bào)道的可促使天麻種子發(fā)芽的真菌有12種,用于生產(chǎn)的萌發(fā)菌均屬于小菇屬真菌,其生活特性如下。

1.1腐生為主,兼性寄生

萌發(fā)菌對(duì)樹葉中的纖維素有強(qiáng)烈的分解和消化能力,多腐生于高山林間落葉上。當(dāng)天麻種子落入感染了萌發(fā)菌的樹葉上時(shí),萌發(fā)菌又可侵入具有生命力的天麻種子。因此,萌發(fā)菌主要營(yíng)腐生生活,但也有兼性寄生的特性。

1.2萌發(fā)菌生長(zhǎng)對(duì)空氣的要求

在自然條件下,主要分布在枯枝落葉層及疏松的表層土壤中。在培養(yǎng)過程中如果培養(yǎng)料裝得太多或瓶蓋太緊,菌絲生活力減弱甚至死亡。說明萌發(fā)菌是一類好氣性真菌,需要有足夠的氧氣才能正常的生長(zhǎng)發(fā)育。

1.3萌發(fā)菌生長(zhǎng)對(duì)溫度的要求

在自然條件下,萌發(fā)菌子實(shí)體一般在夏季出現(xiàn),說明其菌絲生長(zhǎng)需要有較高的溫度。試驗(yàn)表明,萌發(fā)菌在15～30℃溫度范圍內(nèi)均能生長(zhǎng),以25℃時(shí)菌絲生長(zhǎng)為最快,低于20℃或高于28℃菌絲生長(zhǎng)速度明顯減漫,高于30℃以上24h,菌絲將失去生活力,甚至死亡。

1.4萌發(fā)菌生長(zhǎng)對(duì)基質(zhì)含水量的要求

在自然條件下,萌發(fā)菌多生長(zhǎng)在濕度較高的環(huán)境中。試驗(yàn)結(jié)果表明,不同的萌發(fā)菌對(duì)水分的要求不同,但都喜歡生長(zhǎng)在基質(zhì)含水量在100%～200%的高濕環(huán)境中,基質(zhì)含水量過高和過低都會(huì)導(dǎo)致菌絲生長(zhǎng)速度減緩,甚至停止生長(zhǎng)。

1.5萌發(fā)菌生長(zhǎng)對(duì)基質(zhì)酸度的要求

在自然條件下,萌發(fā)菌常生長(zhǎng)在中性及偏酸性環(huán)境。試驗(yàn)結(jié)果表明,萌發(fā)菌菌絲在pH值4.5～7.0均能生長(zhǎng),以pH值5.0～5.5最適宜,堿性條件不利于菌絲生長(zhǎng)。

2萌發(fā)菌的分離與鑒定

2.1菌種的分離

萌發(fā)菌通常分布在山區(qū)較為潮濕的枯枝落葉上,不像蜜環(huán)菌那樣有獨(dú)特的菌索,一般不能直接用肉眼識(shí)別。因此,用于分離萌發(fā)菌的材料十分有限。如果在沒有人為使用萌發(fā)菌的情況下,天麻種子能在樹葉上萌發(fā)形成原球莖,說明這樹葉上肯定有萌發(fā)菌,選取這些樹葉或原球莖作為分離材料(最好選原球莖),從中分離出萌發(fā)菌。具體方法是:在天麻種子成熟季節(jié),從山區(qū)林下收集潮濕的樹葉,洗去泥土后,放入木箱、花盆等容器中,撒上天麻種子,蓋上塑料窗紗,再撒1層樹葉后蓋上沙土。2個(gè)月后觀察是否有天麻種子萌發(fā)。若有,則可取出原球莖并作為萌發(fā)菌的分離材料。取出的原球莖先用清水洗凈,于無菌室中用0.1%升汞水中浸泡1min,再用無菌水沖洗3～4次,最后用滅過菌的濾紙吸去表面的水后切成小塊,分開放入事先準(zhǔn)備好的PDA平面培養(yǎng)基中培養(yǎng),待原球莖小塊處長(zhǎng)出白色菌落后,進(jìn)行菌種的純化。經(jīng)純化獲得單一菌株后進(jìn)行鑒定。

2.2菌種鑒定

在生產(chǎn)上,萌發(fā)菌鑒定最簡(jiǎn)便和實(shí)用的辦法是進(jìn)行天麻種子發(fā)芽試驗(yàn),即將經(jīng)分離所得菌種拌播天麻種子,試驗(yàn)其發(fā)芽情況。萌發(fā)菌大多分布在山區(qū)較為潮濕的枯枝落葉上,說明枯枝落葉是萌發(fā)菌良好的培養(yǎng)基質(zhì),但從現(xiàn)有萌發(fā)菌的試驗(yàn)結(jié)果看,樹葉、玉米芯、棉子殼、麩皮等都可作為培養(yǎng)基。為方便后續(xù)發(fā)芽試驗(yàn),最好選用樹葉作為培養(yǎng)基。具體方法如下:

用250mL的錐形瓶裝上用水浸泡并洗凈的樹葉,稍加壓緊,葉形較大的落葉可適當(dāng)剪小。然后進(jìn)行高壓滅菌,在無菌室將斜面培養(yǎng)基的菌連同培養(yǎng)基挑取一塊,轉(zhuǎn)接在樹葉培養(yǎng)基中,在25℃下培養(yǎng),菌絲長(zhǎng)滿后即可進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)。做種子發(fā)芽試驗(yàn)時(shí),先在直徑約10cm的培養(yǎng)皿底部墊1層薄的海綿,加入適量的水以保持潮濕,然后將已長(zhǎng)滿菌的樹葉放在海綿上,再將天麻種子播撒在菌葉上。在25℃下培養(yǎng),3周以后用放大鏡觀察。也可以用50mL的扁平克氏瓶,底部放海綿,加入適量水,上層放用水浸泡并洗凈的樹葉,高度達(dá)到瓶高的2/3,經(jīng)高壓滅菌后,接菌,待菌絲基本長(zhǎng)滿樹葉后,在樹葉和瓶壁上撒一些種子,通過瓶壁可觀察到樹葉上種子萌發(fā)的動(dòng)態(tài)。

天麻種子只有1層薄薄的種皮,播種時(shí)消毒容易傷胚。

主要采取以下2種方法避免雜菌污染。一是當(dāng)天麻果實(shí)即將開裂而未開裂時(shí),將果實(shí)剪下。在無菌室中,先切去頂端殘存的花冠,用25%酒精擦洗表面消毒,再挑取其中的種子播在有菌樹葉之上。二是將未作任何消毒的種子,直接播在菌葉之上。但是葉面必須長(zhǎng)滿菌,使其占生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì),這樣種子帶上的一些雜菌也不能生長(zhǎng),也能達(dá)到較好的效果。如果在所分離的菌種中有可使天麻種子發(fā)芽且情況滿意的菌種,生產(chǎn)上就可以對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)繁,以準(zhǔn)備天麻種植時(shí)用。同時(shí),有必要對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步鑒定,以確定該菌種是否為一種新的菌種。

3萌發(fā)菌的培養(yǎng)

3.1一級(jí)菌種的培養(yǎng)

在天麻種子萌發(fā)試驗(yàn)中得到肯定結(jié)果并準(zhǔn)備用于天麻生產(chǎn)的菌種,可在無菌條件下將其轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)繁,在22～25℃溫度下避光培養(yǎng),當(dāng)菌絲在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)至2/3或基本長(zhǎng)滿培養(yǎng)基表面時(shí),即可用于生產(chǎn)二級(jí)菌種。

3.2二級(jí)菌種的培養(yǎng)

在無菌條件下,將培養(yǎng)好的一級(jí)菌種轉(zhuǎn)接于已滅菌的二級(jí)固體、半固體或液體菌種培養(yǎng)基上,在25℃恒溫避光條件下培養(yǎng),菌絲長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)基后,所得菌種即為二級(jí)菌種。

3.3三級(jí)菌種(生產(chǎn)種)的培養(yǎng)

將培養(yǎng)好的二級(jí)菌種轉(zhuǎn)接于三級(jí)菌種培養(yǎng)基上,菌絲長(zhǎng)滿后即得三級(jí)菌種。三級(jí)菌種可用于伴播天麻種子,進(jìn)行天麻有性繁殖播種。

4參考文獻(xiàn)

[1] 楊嘉華,屈中權(quán).昭通天麻的研究與開發(fā)[M].昆明:云南科技出版社,2007.