知母寧抗乙肝病毒作用的實(shí)驗(yàn)研究

丁蔚茅

摘要:目的:觀察知母寧的抗乙肝病毒作用。方法:觀察不同濃度知母寧對(duì)體外培養(yǎng)的2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg、HBeAg的抑制作用及對(duì)乙肝模型鴨DHBV-DNA的影響。結(jié)果:知母寧濃度為4 mg/mL時(shí)對(duì)2.2.15細(xì)胞分泌HBeAg有明顯的抑制作用;以200 mg/kg治療乙肝模型鴨10d后DHBV-DNA水平明顯降低。結(jié)論:知母寧有抗乙肝病毒的作用,其機(jī)制可能與抑制HBV-DNA的復(fù)制有關(guān)。

關(guān)鍵詞:知母寧;乙肝病毒;2.2.15細(xì)胞;DHBV-DNA

乙型肝炎為常見(jiàn)病、多發(fā)病,據(jù)統(tǒng)計(jì)我國(guó)已約有一半以上人口經(jīng)受HBV感染[1]。目前對(duì)乙肝的治療多采取綜合療法,其中抗病毒治療是主攻方向,但是到目前為止已發(fā)現(xiàn)的抗HBV藥物療效難盡人意。知母寧(Chinonin)是從多種植物中提取出的一種四羥基吡酮的碳糖苷,屬雙苯吡酮類(lèi)化合物。前期的研究表明Chinonin有抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用、抗皰疹病毒作用等[2~3]。有研究認(rèn)為民間用來(lái)治療肝炎的藏茵陳的有效成分為Chinonin[4]。為了進(jìn)一步深入研究Chinonin的生物活性及藥理特性,我們開(kāi)展了Chinonin抗乙肝病毒作用的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究,以期篩選出新的高效低毒的抗HBV藥物。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞、動(dòng)物

2.2.15細(xì)胞由廣州空軍醫(yī)院提供;1日齡華南麻鴨,由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 藥品與試劑

Chinonin(三九藥業(yè)生化研究所提供);DMEM(GIBCO);胎牛血清(GIBCO),G418(GIBCO),HEPES;MTT(SIGMA);DMSO(廣州新港化工廠生產(chǎn));HBeAg,HbsAg檢測(cè)試劑盒(華美生物工程公司生產(chǎn));DHBV質(zhì)粒(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)所生產(chǎn));缺口翻譯藥盒(promega公司生產(chǎn));α-32P-dCTP(北京亞輝公司生產(chǎn));DHBV陽(yáng)性血清。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

細(xì)胞培養(yǎng)瓶、96W培養(yǎng)板、CO2培養(yǎng)箱(NAPCO 5410)、酶標(biāo)儀(BIO-RAD:3550)、96孔雜交點(diǎn)樣器(美國(guó)Bio-rad公司生產(chǎn))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)

2.2.15細(xì)胞復(fù)蘇后,以DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于細(xì)胞瓶中,長(zhǎng)滿后,用0.06%的胰蛋白酶消化2min~3min,棄消化液,加少量DMEM培養(yǎng)液輕輕吹打,制成3×105/mL單個(gè)細(xì)胞懸液,種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔0.1mL,37℃,5%CO2,48 h,細(xì)胞貼壁后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 HBeAg和HBsAg測(cè)定

將Chinonin配成多個(gè)濃度(從16mg/mL濃度開(kāi)始倍比稀釋),加于已滴有2.2.15細(xì)胞的96孔細(xì)胞板中,0.1mL/孔,每濃度4孔;設(shè)無(wú)藥細(xì)胞對(duì)照組4孔及空白對(duì)照組4孔,每孔加入0.1mL 2%DMEM。加藥培養(yǎng)10d后,吸取培養(yǎng)液于另一96孔板中,即行HBeAg和HBsAg測(cè)定,用酶標(biāo)儀以450nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值(了解抗原的分泌情況)。原96孔板中用MTT染色,每孔加0.4g/L MTT 0.1 mL,37 ℃,5% CO2孵育4 h,棄上清后加DMSO 0.1 mL溶解,然后以490 nm波長(zhǎng)比色測(cè)定OD值(了解細(xì)胞存活情況)。

1.2.3 鴨乙肝模型的建立及給藥

1d齡華南麻鴨,足靜脈注射DHBV陽(yáng)性血清,每只0.2mL,1w后足靜脈取血,檢測(cè)DHBV-DNA陽(yáng)性者進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將鴨隨機(jī)分3組,模型組、Chinonin高劑量組(200mg/kg灌胃)、Chinonin低劑量組(100mg/kg灌胃)。

1.2.4 DHBV-DNA檢測(cè)

分別在給藥前及給藥后5d、10d,停藥后3d,用斑點(diǎn)雜交法檢測(cè)DHBV-DNA。(1)探針的標(biāo)記:DHBV-DNA探針標(biāo)記采用缺口平移法,按Promego藥盒說(shuō)明書(shū)稍加改動(dòng)進(jìn)行。(2)斑點(diǎn)雜交:①點(diǎn)樣:將硝酸纖維素膜用去離子水和10×SSC溶液各浸泡30min,室溫晾干后點(diǎn)膜,40μL/樣,真空抽濾;②變性:將膜分別置于變性液I10min,變性液II 10 min,變性液III 10 min,將變性后的膜室溫晾干,置80℃烤箱中2h,烤干;③預(yù)雜交:將膜置3×SSC-0.1%SDS10mL中,65℃,30min,換10×Dendhart-0.1%SDS10mL中,65℃,4h或過(guò)夜;④雜交:棄預(yù)雜交液,于雜交袋中加入雜交液,封口后42℃,36h~48h;⑤洗膜,用醫(yī)用X線膠片,-70℃感光5d后顯影、定影。

1.2.5 計(jì)算公式及統(tǒng)計(jì)方法數(shù)據(jù)結(jié)果以(x±s)表示,組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),以SPSS9.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Chinonin對(duì)細(xì)胞的毒性作用

Chinonin濃度在16mg/mL、8mg/mL時(shí)對(duì)細(xì)胞的毒性較大,破壞率均>50%,而4mg/mL時(shí)毒性明顯減弱,破壞率為24.03%,且破壞率隨濃度的下降而下降。經(jīng)計(jì)算,Chinonin的半數(shù)毒性濃度(TC50)為6.318。為排除藥物對(duì)HBeAg、HBsAg的抑制作用是由于對(duì)細(xì)胞的毒性所致,故選擇TC50以下的濃度來(lái)評(píng)價(jià)藥效。當(dāng)Chinonin濃度為4mg/mL、2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL時(shí)與細(xì)胞對(duì)照組比較均無(wú)顯著差異,提示這4個(gè)濃度對(duì)細(xì)胞沒(méi)有明顯的毒性作用。

2.2 Chinonin對(duì)抗原的抑制作用

Chinonin在濃度為16mg/mL、8mg/mL、4mg/mL、2mg/mL時(shí)對(duì)HBeAg均有較好的抑制作用,與細(xì)胞對(duì)照組比較,P<0.05。經(jīng)計(jì)算,半數(shù)有效濃度(IC50)=3.322。而對(duì)于HBsAg,Chinonin的抑制作用不明顯,難以觀察到藥物濃度梯度與抑制率之間的相關(guān)關(guān)系。

2.3 Chinonin的治療指數(shù)(TI)

Chinonin對(duì)細(xì)胞的半數(shù)毒性濃度(TC50)=6.318,抑制抗原分泌HBeAg的半數(shù)有效濃度(IC50)=3.322,其治療指數(shù)(TI)=1.902。

2.4 Chinonin對(duì)鴨乙肝模型DHBV-DNA的抑制作用

鴨乙肝模型經(jīng)Chinonin治療后,DHBV-DNA水平均有不同程度的降低。其中Chinonin高劑量組在治療10 d后,DHBV-DNA OD值較模型組顯著降低,P<0.05,停藥3d后,即使DHBV-DNAOD值有上升,但與模型組比較仍有顯著差異。Chinonin低劑量組DHBV-DNAOD值也有降低的趨勢(shì)。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用的2.2.15細(xì)胞模型及鴨乙肝模型均是研究抗肝炎病毒藥物常用的方法。2.2.15細(xì)胞是乙型肝炎病毒基因組轉(zhuǎn)染的人肝癌細(xì)胞HepG2系,其染色體內(nèi)整合有HBV全基因,可表達(dá)乙肝病毒的表面抗原(HBsAg)及e抗原(HBeAg),并可分泌有感染性的乙肝病毒顆粒,故2.2.15細(xì)胞常用作抗HBV藥物最初的體外篩選模型。鴨乙型肝炎病毒與乙型肝炎病毒同屬嗜肝病毒科,兩者在毒粒形態(tài)、結(jié)構(gòu)、基因組成、復(fù)制及傳播方式等方面均很相似。DHBV是研究HBV復(fù)制機(jī)制及篩選抗肝炎病毒藥物的常用模型。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)來(lái)觀察Chinonin的抗乙肝藥效及作用機(jī)理,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Chinonin對(duì)2.2.15細(xì)胞分泌的HBeAg有較好的抑制作用,對(duì)DHBV-DNA也有清除作用。這提示Chinonin抑制抗原的分泌可能是通過(guò)抑制HBV-DNA的復(fù)制和病毒的表達(dá)來(lái)起作用的。

實(shí)驗(yàn)中TI可用來(lái)評(píng)價(jià)藥物臨床應(yīng)用前景,其中TI>2為有效低毒,1

此外,實(shí)驗(yàn)中Chinonin對(duì)HBeAg有較好的抑制作用,而對(duì)HBsAg沒(méi)有明顯的抑制作用,這在一定程度上可解釋臨床為何HBeAg的陰轉(zhuǎn)較HBsAg的陰轉(zhuǎn)容易,這是由于兩抗原的表達(dá)存在不同的調(diào)控機(jī)制,至于其具體的機(jī)制尚需進(jìn)一步的研究。

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