番鴨小鵝瘟病毒云浮株的分離與鑒定

周　全　宋永峰　周　麗　黎　敏　高　恒　宋延華　溫納相

【摘要】2008年初, 廣東云浮思勞片區(qū)番鴨養(yǎng)殖場出現(xiàn)下痢、張口呼吸、腳軟、堆積、采食量減少等癥狀。發(fā)病后的前3天曾經(jīng)用過抗生素治療,但沒有效果,死亡率高達(dá)80%。病理解剖主要表現(xiàn)為腸道中后段膨大約3倍、整個腸道出血嚴(yán)重 ,有凝固性栓子。肝臟腫大,膽囊明顯膨大,腎臟腫脹。為查明原因,筆者對發(fā)病的雛鴨進(jìn)行病毒的分離與鑒定工作,通過病毒分離、PCR、瓊脂擴(kuò)散和動物回歸試驗證實獲得1株番鴨小鵝瘟病毒。經(jīng)番鴨胚接種、雛番鴨攻毒試驗,證實所分離的病毒具有較強(qiáng)的致病性。

【關(guān)鍵詞】番鴨 小鵝瘟病毒 分離鑒定

小鵝瘟是由鵝細(xì)小病毒(Goose parvovirus, GPV)引起的1-5周齡雛番鴨和雛鵝的一種急性或亞急性、高度接觸性傳染病[ 1 ]。該病最早由我國著名學(xué)者方定一于1956年首次發(fā)現(xiàn)[ 2 ],并于1961年在鵝胚中分離到該病毒,目前已呈世界性分布[ 3 ]。臨診癥狀表現(xiàn)為雛番鴨纖維素性腸炎、小腸后段內(nèi)容物形成臘腸樣栓子及肝、腎、心等實質(zhì)臟器的炎癥,可引起雛番鴨20%-90%的死亡率,是嚴(yán)重危害番鴨養(yǎng)殖的重要病毒病[ 4 ]。本研究對一份疑似番鴨小鵝瘟病料進(jìn)行了病毒分離鑒定,現(xiàn)將結(jié)果匯報如下:

1.材料與方法

1.1 材料

疑似番鴨小鵝瘟病料采自廣東省云浮市某番鴨場,健康非免疫番鴨胚和雛番鴨均由思勞孵化廠提供,標(biāo)準(zhǔn)陽性毒株由本室保存,陽性血清由動物防疫站惠贈。

1.2 方法

1.2.1 臨床癥狀與剖檢變化 雛番鴨死前腹瀉嚴(yán)重,糞便呈褐色,瀕死期角弓反張,個別有神經(jīng)癥狀。經(jīng)剖檢可見整個腸道充血、出血嚴(yán)重;腸道后段有栓子,肝、膽囊腫大充血、淤血。

1.2.2 病料的處理 無菌采取疑似感染小鵝瘟瀕死病番鴨的肝臟、腎臟和脾臟,將病料剪碎研磨后,按1∶3比例加入生理鹽水,制成懸液。-70℃/37℃反復(fù)凍融3次,10000r/min離心10min,取上清,過濾除菌后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3番鴨胚接種 取上述病毒液以尿囊腔途徑接種12日齡健康非免疫番鴨胚10枚,每枚0.2mL,同時設(shè)生理鹽水及空白對照組。37℃培養(yǎng),每日觀察番鴨胚發(fā)育和死亡情況,棄去24h內(nèi)死亡胚,無菌收集接種后3～7d死亡的番鴨胚和活胚的尿囊液,經(jīng)無菌檢驗后,低溫保存?zhèn)溆?同時取出胚體觀察其病理變化。

1.2.4鴨胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng) 按常規(guī)方法制備鴨胚原代成纖維細(xì)胞(DEF),當(dāng)DEF長至70%～80%單層時,將GPV病毒液接種于細(xì)胞中,37℃培養(yǎng),觀察細(xì)胞病變。

1.2.5瓊脂擴(kuò)散試驗 按常規(guī)方法應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和分離病毒的番鴨胚尿囊液進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散試驗。

1.2.6 PCR檢測 根據(jù)參考文獻(xiàn)合成小鵝瘟檢測引物,常規(guī)方法提取樣品DNA,進(jìn)行PCR檢測;目的片段約為600bp。

1.2.7病毒致病性測定 將80只雛番鴨隨機(jī)分成8組。前7組分別注射10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,10-7倍稀釋含小鵝瘟病毒的番鴨胚尿囊液,接種量為肌注0.2mL/只,第8組為對照組。分別隔離飼養(yǎng),連續(xù)觀察,記錄死亡情況。按Reed-Muench法計算LD50。

1.2.8動物回歸試驗 將20只12日齡雛番鴨隨機(jī)分為2組,每組10只,一組為試驗組,肌注0.5 mL/只分離的病毒,另一組肌注0.5mL/只生理鹽水作為對照組,相同條件下隔離飼養(yǎng),觀察15天。

2 結(jié)果與分析

2.1 剖檢變化

2.2番鴨胚接種試驗 將待檢病料接種于10只番鴨胚,24h內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)番鴨胚死亡,番鴨胚在24h-96h死亡8枚。胚體觀典型的病變主要為絨毛尿囊膜水腫,有灰白色針尖狀小點;胚體充血、出血;喙、趾、頸部皮膚等均有明顯出血點;肝臟充血,心肌、后腦出血,頭、頸部及兩肋皮下有水腫,出現(xiàn)小鵝瘟臨床癥狀和剖檢特征。結(jié)果見圖3。

2.3鴨胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)試驗 DEF接種病毒后,紡錘形的鴨胚成纖維細(xì)胞出現(xiàn)圓縮、脫落等明顯的病變,說明病毒能在番鴨胚原代細(xì)胞中增殖,結(jié)果見圖4、圖5。

2.4瓊脂擴(kuò)散試驗 分別用標(biāo)準(zhǔn)陽性血清與培養(yǎng)的病毒進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散試驗。中央孔為標(biāo)準(zhǔn)陽性血清,外周為6份培養(yǎng)病毒的番鴨胚尿囊液,每孔加入200uL,酒精燈封底后,置37℃濕盒中,溫育48h后,觀察結(jié)果,可見6份尿囊液均與標(biāo)準(zhǔn)陽性血清形成明顯的沉淀線,結(jié)果見圖6。

2.5 PCR檢測 按照參考文獻(xiàn)的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增,電泳結(jié)果可見到清晰的目的條帶,即GPV PCR陽性,見圖7。

1:陽性對照、2:陰性對照、3:分離毒株、M:marker2000

2.6病毒致病性測定

將不同稀釋度的含病毒的番鴨胚尿囊液接種健康非免疫番鴨后,連續(xù)觀察9d,記錄死亡情況,用Reed-Muench法計算。

從下表可以看出,該毒株的LD50在10-4和10-5之間,按公式計算(62- 50)/(62- 33)=12/29=0.4,根據(jù)統(tǒng)計學(xué)的方法得出分離毒株的LD50= 10-4.6/0.2mL。

2.7動物回歸試驗結(jié)果

接種含毒尿囊液的雛番鴨于接種后第5天開始出現(xiàn)癥狀,接毒組出現(xiàn)輕微的腹瀉、不愿走動、精神萎頓、食欲減退;后期嚴(yán)重腹瀉,呼吸困難,兩腳麻痹,行走困難,臥地不起,發(fā)病率為100%。

剖檢可見小腸粘膜充血或出血,肝臟稍腫大,呈深紫色,表面有出血點;膽囊明顯膨大,充滿暗綠色膽汁;腸粘膜彌散性出血,腸道尤其是靠近回盲部的腸段呈現(xiàn)典型的卡他性、纖維素性、壞死性腸炎的變化,質(zhì)地堅實,似香腸樣,壞死的腸粘膜、滲出的纖維素等凝固形成的栓子。陰性對照組的10只雛番鴨正常。

3. 小結(jié)和討論

3.1 盡管小鵝瘟病毒的血清型只有一種,其自然感染宿主也只有雛番鴨和雛鵝, 但近年來研究發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)分離毒株毒力不同[ 8,9 ], 使該病難于預(yù)防和治療, 這也是常規(guī)疫苗的免疫保護(hù)失敗的主要原因[ 11 ]。

3.2 本試驗分離的小鵝瘟地方株能使番鴨胚產(chǎn)生特征性病變;在動物回歸試驗中, 可使雛番鴨出現(xiàn)典型小鵝瘟癥狀;本病毒能被小鵝瘟陽性血清中和;分離毒株這些特性與鵝細(xì)小病毒一致, 確認(rèn)所分離病毒株為鵝細(xì)小病毒[ 12 ], 該病毒是雛番鴨和雛鵝疫病的主要病原之一, 對番鴨養(yǎng)殖業(yè)危害極大[ 13 ]。

參考文獻(xiàn):

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作者簡介:周全(1982-),男,湖北黃岡人,本科,現(xiàn)于廣東溫氏食品集團(tuán)研究院工作,主要從事禽病相關(guān)研究工作。