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    慢病毒介導(dǎo)的解整合素-金屬蛋白酶17 RNA干擾對(duì)氣道上皮細(xì)胞MMP-9表達(dá)及NF-κB活性的影響

    2014-05-14 11:21:42嚴(yán)建平李亞清
    關(guān)鍵詞:室溫培養(yǎng)液試劑盒

    嚴(yán)建平,李亞清,鐘 暉,陳 淳,顧 超

    肺組織彈性物質(zhì)的降解是慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease,COPD)特征性的病理表現(xiàn)[1],也是導(dǎo)致COPD患者進(jìn)行性氣流受限的重要原因。蛋白酶-抗蛋白酶失衡在這一過程中發(fā)揮著重要作用?;|(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase,MMP-9)是基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)超家族成員之一。活化的MMP-9可作用于彈性蛋白及IV型膠原等,引起細(xì)胞外基質(zhì)損傷。MMP-9在COPD患者血清中的表達(dá)明顯升高,且與氣流受限和疾病進(jìn)展相關(guān)[2]。Foronjy等[3]通過轉(zhuǎn)基因小鼠實(shí)驗(yàn)研究表明MMP-9的過表達(dá)和酶活性增加可導(dǎo)致肺泡彈性物質(zhì)的丟失、膠原含量減少,使肺組織發(fā)生肺氣腫樣改變。但其表達(dá)調(diào)控機(jī)制仍有待于研究。解整合素-金屬蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase,ADAM)17屬于ADAM蛋白酶家族成員之一,在與一系列生理、病理活動(dòng)有關(guān)的關(guān)鍵因子的細(xì)胞外域分離(shedding)過程中起著重要作用,被稱為“信號(hào)系統(tǒng)剪刀”。腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α是一種具有廣泛生物學(xué)活性的細(xì)胞因子,在機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞死亡或生存等過程中起著重要作用。Wright等[4]研究表明香煙煙霧可通過 TNF-α信號(hào)通路上調(diào)肺血管MMP-9、MMP-2、MMP-12的表達(dá)。pro-TNF-α是可溶型TNF-α的前體,通過其胞外域水解脫落形成可溶型TNF-α,ADAM17在這一過程中起著重要作用。因此,我們推測(cè)ADAM17可能通過調(diào)控TNF-α信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在調(diào)節(jié)MMP-9表達(dá)中發(fā)揮作用。

    RNAi(RNA interference)技術(shù)是一種新興的由外源性或細(xì)胞內(nèi)源性的雙鏈RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默技術(shù),已在基因功能、發(fā)育生物學(xué)和基因治療等研究有了廣泛的應(yīng)用[5]。慢病毒載體介導(dǎo)的RNAi不但可以感染非分裂期細(xì)胞,還具有容納外源性目的基因片段大、目的基因能長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)、免疫反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)。因此,本課題通過構(gòu)建ADAM17 siRNA慢病毒表達(dá)載體,探討ADAM17 RNAi對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的 HBE4-E6/E7細(xì)胞 MMP-9表達(dá)的影響,并進(jìn)一步研究 TNF-α/核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)信號(hào)通路在其中的作用,為治療COPD提供新的研究靶點(diǎn)。

    1 材料

    1.1 細(xì)胞株 正常人氣道上皮細(xì)胞系HBE4-E6/E7購(gòu)自美國(guó)ATCC公司,293T細(xì)胞系購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)。

    1.2 試劑和儀器 慢病毒包裝系統(tǒng) pLVTHM、pRsv-REV、pMDlg-pRRE和pMD2G-VSVG購(gòu)自Trono(University of Geneva,Switzerland).ClaI,MluI,XbaI和 EcoRI購(gòu)自 TaKaRa(Otsu,Shiga,Japan)。AxyPrep質(zhì)粒小劑量制備試劑盒購(gòu)自Axygen公司。脂質(zhì)體Lipofectamine 2000和大腸桿菌菌株DH5α購(gòu)自Invitrogen(Carlsbad,CA,USA)。胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。RNAex購(gòu)自上海華舜公司。MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNasin購(gòu)自 Promega(Madison,WI,USA)。SYBR Master Mixture購(gòu)自 Toyobo公司。Taq DNA聚合酶購(gòu)自北京天為時(shí)代公司。LPS(來源于E.coli 0111∶B4)、DMEM培養(yǎng)液、吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)、明膠購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。Etanercept購(gòu)自美國(guó)Immunex公司。兔抗人MMP-9單克隆抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology公司。NE-PER細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)提取試劑盒以及LightShiftTMChemiluminescent EMSA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司。二氧化碳培養(yǎng)箱為美國(guó)Thermo公司,倒置相差顯微鏡為日本OLYMPUS公司。

    2 方法

    2.1 ADAM17 siRNA設(shè)計(jì)、質(zhì)粒載體構(gòu)建及慢病毒包裝 根據(jù)人ADAM17 mRNA序列(Genebank number:NM_003183)選擇位于2021-2041之間的特殊序列 5′-CCTATGTCGATGCTGAACAAA-3′為干擾靶序列。含干擾靶序列的DNA寡核苷酸由上海生物工程有限公司化學(xué)合成。并經(jīng)過退火,以ClaI和MluI雙酶切,在 T4 DNA連接酶的作用下插入pLVTHM表達(dá)載體。制備DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,轉(zhuǎn)化,挑選陽(yáng)性克隆,通過限制酶切和DNA直接測(cè)序鑒定。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為0.5×109cells·L-1。取20μg重組 pLVTHM載體,10μg pMD2G-VSVG,10μg pMDlg-pRRE和10μg pRsv-REV加入無菌水定容至1 800μl,再加入 CaCl2(2.5 mol·L-1)溶液 200μl,混勻,加入 2×BBS緩沖鹽溶液2 000μl,室溫放置30 min形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。當(dāng)293T細(xì)胞密度達(dá)60%~70%時(shí),將轉(zhuǎn)染復(fù)合物和磷酸鈣混合液轉(zhuǎn)移至含單層細(xì)胞的培養(yǎng)液中,混勻,培養(yǎng)12 h后棄去培養(yǎng)液,PBS反復(fù)沖洗3次。加入細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)72 h;收集上清液,4℃、4 000 r· min-1離心 10 min,0.45μm濾器過濾上清液,離心后于-80℃冰箱保存。以慢病毒濃縮液感染293T細(xì)胞,采用倍比稀釋法和流式細(xì)胞術(shù)(FACS)檢測(cè)病毒滴度。

    2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 HBE4-E6/E7細(xì)胞復(fù)蘇后用含10% 胎牛血清、105U·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素DMEM培養(yǎng)液混懸細(xì)胞,充分混勻,在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)2.5 h后,消化、收集細(xì)胞,用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液混懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度約為1×109cells·L-1,進(jìn)一步培養(yǎng)。在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中,將HBE4-E6/E7細(xì)胞分成4組:第 3、4組分別以 1 mg·L-1etanercept(A recombinant human TNFR p75-Fc fusion protein)(Enbrel,Immunex,Seattle)、50 mg·L-1PDTC預(yù)處理30 min;接著第2、3、4組分別加入終濃度為100μg·L-1LPS刺激24 h,第1組未用 LPS刺激。在RNAi干擾實(shí)驗(yàn)中,一方面將HBE4-E6/E7細(xì)胞分成4組:第1組為空白對(duì)照組;第2組為L(zhǎng)PS刺激組;第3組以LV-NC-siRNA慢病毒以MOI 15感染HBE4-E6/E7細(xì)胞72 h,第4組以 LV-ADAM17-siRNA慢病毒以MOI 15感染HBE4-E6/E7細(xì)胞72 h,接著第3、4組以100μg·L-1LPS刺激24 h。另一方面將A549細(xì)胞分成4組:第1組為空白對(duì)照組;第2組為TNF-α刺激組;第3組以LV-ADAM17-siRNA慢病毒以MOI 15感染HBE4-E6/E7細(xì)胞72 h,接著以1 mg·L-1TNF-α刺激24 h;第4組以50 mg·L-1PDTC預(yù)處理 HBE4-E6/E7細(xì)胞30 min,接著以1 mg·L-1TNF-α刺激24 h。分別收集各組細(xì)胞及細(xì)胞上清液,-80℃冰箱保存、備測(cè)。

    2.3 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) 以TRIzol提出總RNA。按MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說明合成cDNA:將2μg RNA與2μl Oligo(dT)15(0.5 g·L-1)混合,補(bǔ)充DEPC處理的無菌水至總體積為12μl,離心,70℃溫育5 min,迅速置冰上,分別加入5×buffer 5μl,RNase(40 U·μl-1)0.6μl,dNTP(10 mmol·L-1)1.25μl,MMLV(200 U·μl-1)1μl,補(bǔ)充DEPC處理的超純水至總體積為25μl,離心,37℃溫育1h,95℃5 min以滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。根據(jù)目的基因分別加入:10×buffer 2.5μl,MgCl2(25 mmol·L-1)2.0μl,dNTP(10 mmol·L-1)1.0μl,上游引物(10μmol·L-1)1.0μl,下游引物(10μmol·L-1)1.0μl,逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 2.5μl,Taq酶 0.5μl,補(bǔ)充無菌去離子水至總體積為25μl,離心混勻,95℃預(yù)變性5 min,然后完成35個(gè)循環(huán),PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳,用UVP-GDS8000凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行拍照、圖像灰度分析,將目的基因擴(kuò)增片段灰度值與內(nèi)參照β-actin擴(kuò)增片段灰度值的比值作為目的基因mRNA表達(dá)的定量指標(biāo)。引物見Tab 1,由北京奧科生物科技公司設(shè)計(jì)和合成:MMP-9(Genebank:NM_004994)引物,上游 5′-TTGACAGCGACAAGAAGTGG-3′; 下 游 5′-GGCACAGTAGTGGCCGTAG-3′,產(chǎn)物 388bp。β-actin上游 5′-GGCACCACACCTTCTACAATGA-3′;下 游 5′-TCAGGAGGAGCAGCAATGATCTTG-3′,產(chǎn)物 745 bp。

    Tab 1 Primer sequences and reaction conditions used for reverse transcriptase polymerase chain reaction

    2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 收集各組細(xì)胞上清液,2 000 r·min-1離心5 min,棄去沉淀,以 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中的TNF-α濃度。根據(jù)TNF-αELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作,主要步驟如下:每孔加入100μl稀釋液 RD1-85。分別加入50μl標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品或待測(cè)樣品。室溫溫育2 h后吸干,反復(fù)洗滌4次。每孔加入100μl TNF-α結(jié)合物,室溫溫育1 h。吸干,洗滌4次。每孔加入200μl底物溶液,避光室溫溫育30 min。每孔加入50μl終止液終止反應(yīng),30 min內(nèi)在450 nm測(cè)定其吸光值。

    2.5 Western blot 將各組含20μg蛋白的上清液在100℃沸水中變性5 min,分別上樣于8%SDSPAGE加樣孔中,電泳。當(dāng)溴酚藍(lán)染液移至膠底邊時(shí),取下凝膠,4℃、350 mA電轉(zhuǎn)移1 h,將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上。接著將硝酸纖維素膜置于TBS-T(TBS、5%脫脂奶粉、0.1%Tween)中室溫孵育1 h。然后將硝酸纖維素膜在以1∶2 500稀釋的兔抗人MMP-9單克隆抗體中室溫孵育1 h。TBS-T洗膜5次后,將硝酸纖維素膜在以1∶40 000稀釋的辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)中室溫孵育1 h。TBST洗膜5次后以增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(enhanced chemiluminescence solution,ECL)顯影。用 UVP-GDS8000凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描攝像、圖像灰度分析。

    2.6 凝膠阻滯分析實(shí)驗(yàn) 用NE-PER細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)提出試劑盒提出細(xì)胞核蛋白,按試劑盒說明操作。由北京奧科生物科技公司設(shè)計(jì)、合成NF-κB雙鏈寡核甘酸探針。生物素標(biāo)記NF-κB探針序列,x代表生物素:5′-xGCCTGGGAAAGTCCCCTCAACT-3′(a),5′-xAGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3′(b)。未用生物素標(biāo)記 NF-κB探針序列:5′-GCCTGGGAAAGTCCCCTCAACT-3′(a),5′-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3′(b)。以 Light-ShiftTMChemiluminescent EMSA試劑盒檢測(cè) NF-κB活性,步驟如下:制備5% 非變性聚丙烯酰胺凝膠,100 V預(yù)電泳30 min,室溫孵育含50μg·L-1Poly(dI·dC)、0.05%NP-40、50 mmol·L-1KCl、5 mmol·L-1MgCl2、10 mmol·L-1EDTA的結(jié)合反應(yīng)體系20 min后,加入5μl的5×loading buffer,混勻后取20μl結(jié)合反應(yīng)體系上樣,100 V電泳,接著以380 mA(~100V)電轉(zhuǎn)移1 h,使結(jié)合反應(yīng)體系至尼龍膜上。將膜置于干燥的紙上(有溴酚蘭面朝上)1 min,迅速用254 nm紫外燈距離膜0.5 cm處紫外交聯(lián)10 min。以ECL方法顯影,用UVP-GDS8000凝膠成像分析系統(tǒng)掃描、分析條帶,根據(jù)其灰度值分析NF-κB活性。

    2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以ˉx±s表示,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用配對(duì)t檢驗(yàn)和單因素方差分析(組間差異用F檢驗(yàn),組間兩兩比較用q檢驗(yàn))。

    3 結(jié)果

    3.1 Etanercept和 PDTC對(duì) LPS誘導(dǎo)的 HBE4-E6/E7細(xì)胞MMP-9的表達(dá)及NF-κB活性的影響在LPS刺激下,HBE4-E6/E7細(xì)胞中MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05),見Fig 1;NF-κB的活性在LPS刺激下亦明顯增加(P<0.05),見Fig 2。Etanercept和 PDTC明顯抑制 LPS誘導(dǎo)的MMP-9 mRNA和蛋白的表達(dá)(P<0.05),見 Fig 1;Etanercept和PDTC亦明顯抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB的活性(P<0.05),見 Fig 2。

    3.2 慢病毒介導(dǎo)的ADAM17 RNAi對(duì)LPS誘導(dǎo)的MMP-9表達(dá)及NF-κB活性的影響 慢病毒介導(dǎo)的ADAM17 RNAi可明顯降低HBE4-E6/E7細(xì)胞上清液中 TNF-α蛋白水平(P<0.05),見 Fig 3,并明顯抑制LPS誘導(dǎo)的MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)(P<0.05),見Fig 4;當(dāng)以 LV-ADAM17-siRNA重組慢病毒感染HBE4-E6/E7細(xì)胞72 h,再以LPS刺激24 h,LPS誘導(dǎo)的 NF-κB的活性明顯下降(P<0.05),見Fig 5。而當(dāng)以 LV-NC-siRNA重組慢病毒感染HBE4-E6/E7細(xì)胞72 h后再以 LPS刺激24 h,和僅以LPS刺激組比較,LPS誘導(dǎo)的MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)及NF-κB的活性均無明顯變化(P>0.05),見 Fig 4,5。

    Fig 1 Effects of Etanercept and PDTC on MMP-9 mRNA(A and B)and protein(C and D)expressions induced by lipopolysaccharide(n=6)

    Fig 2 Effects of etanercept and PDTC on NF-κB activity induced by lipopolysaccharide(n=4)

    Fig 3 Effects of ADAM17 RNAi on TNF-αexpression of airway epithelial cells induced by lipopolysaccharide(n=6)

    Fig 4 Effects of ADAM17 RNAi on MMP-9 mRNA(A and B)and protein(C and D)expressions induced by lipopolysaccharide(n=6)

    Fig 5 Effects of ADAM17 RNAi on NF-κB activity induced by lipopolysaccharide(n=4)

    3.3 慢病毒介導(dǎo)的 ADAM17 RNAi不能阻斷TNF-α誘導(dǎo)的 MMP-9表達(dá)及 NF-κB活性 在TNF-α刺激下,HBE4-E6/E7細(xì)胞中 MMP-9 mRNA和蛋白的表達(dá)明顯增加(P<0.05),見 Fig 6,TNF-α可誘導(dǎo)NF-κB活性明顯升高(P<0.05),見Fig 7。以LV-ADAM17-siRNA重組慢病毒感染HBE4-E6/E7細(xì)胞72 h后再以TNF-α刺激24 h,和僅以TNF-α刺激組比較,TNF-α誘導(dǎo)的MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)及NF-κB的活性均無變化(P>0.05),見 Fig 6,7。PDTC則明顯抑制TNF-α誘導(dǎo)的MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)及 NF-κB的活性(P<0.05),見 Fig 6,7。

    4 討論

    NF-κB是一種多向性核轉(zhuǎn)錄因子,因其與免疫球蛋白κ輕鏈基因的增強(qiáng)子結(jié)合而得名。NF-κB廣泛存在于各種細(xì)胞中,可被TNF-α、LPS等多種因素激活,參與調(diào)控IL-8、TNF-α等多種基因的表達(dá),在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、機(jī)體免疫功能等過程中發(fā)揮重要作用[6-7]。PDTC是 NF-κB活化的特殊抑制劑,可抑制IκBα的降解、阻止IκB和 NF-κB復(fù)合體的解離,從而抑制NF-κB的活化過程[8]。本研究中 LPS刺激使HBE4-E6/E7細(xì)胞MMP-9表達(dá)明顯增加,NF-κB活性亦明顯升高,etanercept和PDTC則均可阻斷這一過程。這說明 TNF-α/NF-κB信號(hào)通路在LPS誘導(dǎo)的HBE4-E6/E7細(xì)胞MMP-9表達(dá)中起重要的調(diào)控作用。Hozumi等[9]通過離體實(shí)驗(yàn)研究也表明TNF-α刺激可通過NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)正常人支氣管上皮細(xì)胞MMP-9表達(dá)。

    Fig 6 Effects of ADAM17 RNAi on MMP-9 mRNA(A and B)and protein(C and D)expressions induced by TNF-α(n=6)

    Fig 7 Effects of ADAM17 RNAi on NF-κB activity of airway epithelial cells induced by TNF-α(n=4)

    ADAM-17在proTNF-α轉(zhuǎn)化成可溶的TNF-α中起重要作用,雖然 MMP-7、MMP-14、MMP-17、ADAM-10也與 proTNF-α的脫落有關(guān),但是 ADAM-17對(duì)proTNF-α的脫落作用是最強(qiáng)的,且其對(duì) proTNF-α脫落特異性是其他MMP對(duì)proTNF-α脫落特異性的100~1 000倍,故 ADAM-17又稱 TNF-α轉(zhuǎn)化酶(tumour necrosis factor-α converting enzyme,TACE)[10]。ADAM-17最顯著的功能是分離 TNF-α、表皮生長(zhǎng)因子、肝素結(jié)合樣表皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α等多種跨膜蛋白的胞外域[11]。本研究中LPS刺激使HBE4-E6/E7細(xì)胞上清液TNF-α水平明顯升高,而慢病毒介導(dǎo)的ADAM17 RNAi可降低LPS誘導(dǎo)的 HBE4-E6/E7細(xì)胞 TNF-α表達(dá),明顯抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB活性,使LPS誘導(dǎo)的MMP-9的表達(dá)相應(yīng)地明顯降低。但慢病毒介導(dǎo)的ADAM17 RNAi不能阻斷以TNF-α直接刺激所引起的MMP-9表達(dá)增加和NF-κB活性升高;而PDTC則仍可抑制TNF-α直接刺激引起NF-κB活化,并使TNF-α直接誘導(dǎo)的MMP-9表達(dá)明顯下降。說明ADAM17是通過調(diào)節(jié)TNF-α細(xì)胞外域脫落參加調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)的MMP-9表達(dá)過程,但不能直接阻斷TNF-α下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

    因此,本研究發(fā)現(xiàn)TNF-α/NF-κB信號(hào)通路在LPS誘導(dǎo)的MMP-9表達(dá)中起重要調(diào)控作用,慢病毒介導(dǎo)的 ADAM17 RNAi可通過阻斷 TNF-α/NF-κB信號(hào)通路的上游來調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞MMP-9的表達(dá),為COPD的治療提供了新的研究靶點(diǎn)。

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