微透析與LC-MSn聯(lián)用測定腦組織中咪達(dá)唑侖／1′-羥基咪達(dá)唑侖及其腦內(nèi)藥代特征的研究

何雪輝，楊志宏，孫曉波

細(xì)胞色素 P450（cytochrome P450，CYP450）是體內(nèi)重要的I相代謝酶，參與眾多內(nèi)外源性化合物的代謝。CYP450在體內(nèi)分布廣泛，研究發(fā)現(xiàn)大腦中存在少量的CYP450，約是肝臟CYP450的0.5～2%［1］。雖然大腦中CYP450酶的含量遠(yuǎn)低于肝臟，但腦內(nèi)CYP450酶活性或表達(dá)的小幅度變化，可能明顯影響腦內(nèi)環(huán)境下中樞藥物的代謝、腦部內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定及腦組織功能。CYP3A亞族是CYP450的重要成員，約占CYP450酶系的30%，臨床上約60%藥物是經(jīng)CYP3A代謝的［2］。腦部CYP3A主要分布在神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞上［3］，對腦內(nèi)藥物的生物轉(zhuǎn)化過程起重要作用；同時，藥物同樣能夠影響腦部CYP3A的活性和表達(dá)。例如抗抑郁藥阿普唑侖［4］、抗癲癇藥物苯妥英鈉和卡馬西平［5］。因此，進(jìn)行腦CYP3A和藥物腦內(nèi)藥代特征的研究對中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物的開發(fā)和臨床用藥指導(dǎo)具有重要價值。

微透析技術(shù)（microdialysis，MD）是一種在線活體取樣技術(shù)，在腦內(nèi)藥物代謝動力學(xué)研究中具有重要應(yīng)用，如腦內(nèi)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)、腦靶向分布研究等。咪達(dá)唑侖（midazolam，MDZ）幾乎全部經(jīng)CYP3A代謝，是2006年以來FDA藥物相互作用研究指南中的推薦探針［6］，廣泛用于體內(nèi)及體外CYP3A酶研究。其主要代謝產(chǎn)物為 1′-羥基咪達(dá)唑侖（1′-hydroxymidazolam，1′-OH MDZ）。MDZ作為非 P-糖蛋白底物，脂溶性強(qiáng)，易于跨越血腦屏障，其清除主要與CYP3A活性有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)將采用 MD技術(shù)研究 MDZ／1′-OH MDZ的腦內(nèi)藥代特征。由于腦中CYP450酶的含量較低，因此開發(fā)靈敏度高、準(zhǔn)確穩(wěn)定的LC-MSn檢測方法尤為關(guān)鍵。MDZ／1′-OH MDZ的 LC-MSn測定方法已有報(bào)道，本文對已有方法進(jìn)行改進(jìn)，提升靈敏度、縮短檢測分析時間，以滿足腦CYP3A酶研究的需求。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1200液相色譜儀（美國Agilent公司）；3200 QTrap串聯(lián)四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX公司），Turbo Ionspray離子源，Analyst 1.6數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；腦立體定位儀（美國Stoeling公司），微透析系統(tǒng)（瑞典 CMA公司），MAB6.14.4同心圓型腦微透析探針（截留分子量15 ku，瑞典MAB公司）。

1.2 藥品與試劑 MDZ、1′-OH MDZ對照品購自美國 Cerilliant公司，批號分別為 FE042209-01和FD050034-02；咪達(dá)唑侖注射液購自江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，批號為20130502；地西泮（diazepam，DZP）對照品購自中國食品藥品檢定研究院，批號100364-200301。乙腈（色譜純）購自美國Honeywell公司，乙酸銨購自Dikmapure公司，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。微透析液為人工腦脊液（artificial cerebrospinal fluid，aCSF）：NaCl 147 mmol·L－1、KCl 2.7 mmol·L－1、CaCl21.2 mmol·L－1、MgCl20.85 mmol·L－1，調(diào)節(jié)pH在7.20～7.40。

1.3 動物 SPF級健康♂ SD大鼠4只，體質(zhì)量（270±10）g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，合格證號SCXK（京）2012－0001。

2 方法和結(jié)果

2.1 溶液的配置 對照品溶液的制備：將MDZ和1′-OH MDZ對照品分別用適量甲醇稀釋成1 mg·L－1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。用 aCSF分別稀釋 MDZ和1′-OH MDZ標(biāo)準(zhǔn)溶液，制備二者工作曲線。MDZ濃度為0.78、1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100μg·L－1；1′-OHMDZ濃度為 0.195、0.39、0.78、1.56、3.125、6.25、12.5μg·L－1。

IS溶液的制備：精密稱取DZP對照品1 mg，置于1 ml甲醇中，配制成1 g·L－1溶液作為貯備液（于4℃下避光保存）。用aCSF稀釋成30μg·L－1的內(nèi)標(biāo)溶液。

靜脈注射用MDZ溶液的配制：以生理鹽水稀釋MDZ注射液，配制成2.5 g·L－1藥液。

2.2 測定條件 色譜條件：Agilent Eclipse Plus-C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，3.5μm）；流動相A水（2 mmol·L－1乙酸銨），B乙腈，梯度洗脫（0～0.2 min，乙腈30%～95%；0.2～5 min，95%乙腈，流速0.3 ml·min－1；進(jìn)樣量 8μl；柱溫 30℃。質(zhì)譜參數(shù)：電噴霧離子化（ESI）；離子極性 Positive；多反應(yīng)離子監(jiān)測（MRM）；離子噴霧電壓（5500 V）；離子源溫度（400℃）；氣簾氣壓力（40 psi）；MDZ m／z：326.1／291.1；1′-OH MDZ m／z：342.1／324.1；DZP（IS）m／z：285.1／154.0。

2.3 微透析樣品處理 取微透析樣品16μl，加入8μl的地西泮（30μg·L－1），混勻，取 8μl直接在線進(jìn)樣。

2.4 專屬性考察 將空白aCSF溶液及微透析樣品進(jìn)行LC-MSn檢測。本實(shí)驗(yàn)條件下，MDZ、1′-OH MDZ及內(nèi)標(biāo)DZP色譜峰形良好且無干擾。結(jié)果如Fig 1，2所示，本方法具有較好的專屬性。

Fig 1 Full-scan mass spectra of MDZ（A），1′-OH MDZ（B）and IS（C）

Fig 2 MRM chromatograms of MDZ，1′-OH MDZ and IS

2.5 線性關(guān)系及最低定量限 如“2.1”項(xiàng)制備MDZ和1′-OH MDZ的工作曲線，按微透析樣品處理方法處理進(jìn)樣。利用樣品與內(nèi)標(biāo)峰面積比值Y對樣品質(zhì)量濃度X（μg·L－1）做權(quán)重為X－2的線性回歸，計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)（r）。所得回歸方程＾YMDZ＝0.02320X＋0.00318（r＝0.9976），＾Y1′-OHMDZ＝0.1101X－0.007137（r＝0.9993）。以 S／N＝10為最低定量限，MDZ及1′-OH MDZ的最低定量限為0.2μg·L－1。

2.6 精密度和準(zhǔn)確度 取低、中、高濃度為1.56、6.25、50μg·L－1的 MDZ對照品工作液；低、中、高濃度為 0.39、1.56、6.25μg·L－1的 1′-OH MDZ對照品工作液?？疾炫鷥?nèi)變異和連續(xù)3 d的批間變異情況。結(jié)果見Tab 1，測得MDZ及1′-OH MDZ的批內(nèi)和批間RSD、RE均小于10%。

Tab 1 Precision and accuracy of MDZ and 1′-OH MDZ（ˉx±s，n＝5）

2.7 穩(wěn)定性 取低、中、高濃度為1.56、6.25、50μg·L－1的 MDZ對照品工作液，低、中、高濃度為0.39、1.56、6.25μg·L－1的 1′-OH MDZ對照品工作液。每個濃度5個樣品。①放置－20℃冰箱保存1周，取出后室溫融解，按“2.3”項(xiàng)處理樣品，測定藥物濃度。②4℃放置12 h后進(jìn)樣，測定藥物濃度。測得 MDZ、1′-OH MDZ的 RE值分別在 －9.86%～5.47%、－9.50%～－6.65%范圍內(nèi)，RSD值在2.60%～6.02%、2.18%～6.15%范圍內(nèi)。結(jié)果表明，MDZ和1′-OH MDZ在－20℃保存1周及4℃放置12 h較為穩(wěn)定。

2.8 方法回收率 使用空白aCSF稀釋MDZ，其濃度為 1.56、6.25、50μg·L－1，空白 aCSF稀釋1′-OH MDZ其濃度為0.39、1.56、6.25μg·L－1，對照品溶液在擬定分析條件下測定記錄樣品和IS峰的比值，帶入同一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算相應(yīng)濃度后除以真實(shí)樣品濃度。測得MDZ、1′-OH MDZ方法回收率分別在91.78%～98.67%、93.55%～98.18%范圍內(nèi)。

2.9 基質(zhì)效應(yīng) 分別使用空白aCSF、純水稀釋MDZ對照品溶液，其濃度為 1.56、6.25、50μg·L－1；分別使用空白 aCSF、純水稀釋 1′-OH MDZ對照品溶液，其濃度為 0.39、1.56、6.25μg·L－1，按“2.3”項(xiàng)處理樣品，進(jìn)樣。記錄峰面積比A1／A2。測得結(jié)果A1／A2的值在90.09% ～109.14%之間，表明MDZ和1′-OH MDZ基本無基質(zhì)效應(yīng)。

3 藥動學(xué)研究

3.1 微透析樣品采集 大鼠腹腔注射烏拉坦（1.2 g·kg－1）麻醉后采用腦立體定位儀固定大鼠頭部，探針植入左側(cè)側(cè)腦室（定位 AP：－0.8 mm，ML：－1.6 mm，DV：－2.0 mm）。探針在2μl·min－1流速下體內(nèi)平衡1 h后，股靜脈注射 MDZ（5 mg·kg－1），持續(xù)收集大腦的微透析樣品2.4 h，收集時間間隔為 8 min。LC-MSn方法檢測 MDZ和 1′-OH MDZ濃度。

3.2 探針回收率測定 采用增量法在37℃水浴條件以相同的流速、時間間隔測定MDZ和1′-OH MDZ腦微透析探針回收率。Cm代表已知濃度的對照品溶液，Cdial代表微透析樣品。根據(jù)公式R＝Cdial／Cm計(jì)算探針回收率 RMDZ＝（19.93±2.35）%、R1′-OHMDZ＝（21.83±2.62）% 。

3.3 數(shù)據(jù)處理 通過探針回收率分別將MDZ和1′-OH MDZ折算為腦內(nèi)真實(shí)濃度，繪制藥時曲線，見Fig 3。采用WinNonlin 6.1軟件以統(tǒng)計(jì)矩方法計(jì)算其主要的代謝動力學(xué)參數(shù)：消除速率常數(shù)（K e）、半衰期（T12）、表觀分布容積（Vd-F）、消除率（CLF）、藥時曲線下面積（AUC）和平均滯留時間（MRT），結(jié)果見 Tab 2。

Tab 2 Pharmacokinetic parameters of MDZ and 1′-OH MDZ in rat brain（ˉx±s，n＝4）

4 討論

4.1 腦代謝 腦代謝研究在中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物的開發(fā)、臨床用藥指導(dǎo)及個體化給藥方案中具有重要地位。由于代謝酶的含量及種類具有組織特異性，藥物在腦局部與肝臟的代謝行為可能具有明顯差異。抗抑郁藥阿普唑侖在大腦主要代謝成藥理活性較強(qiáng)的α-羥基阿普唑侖；在肝臟中主要代謝產(chǎn)物則為4-羥基阿普唑侖［4］，研究發(fā)現(xiàn)造成此現(xiàn)象的主要原因是代謝酶CYP3A43在腦中表達(dá)較高。

MDZ已經(jīng)廣泛用于體內(nèi)及體外CYP3A酶研究，但是其在大鼠腦內(nèi)藥代特征未見報(bào)道，此次MDZ／1′-OH MDZ大鼠腦內(nèi)藥代參數(shù)為國內(nèi)外首次報(bào)道。

Fig 3 Concentration-time curve of MDZ and1′-OH MDZ in brain after iv administration of MDZ（n＝4）

4.2 微透析取樣方式 腦內(nèi)藥代動力學(xué)的研究方式主要包括全腦勻漿法［7］、腦脊液抽取法［8］和微透析法［9］。與其他方法相比，微透析技術(shù)對實(shí)驗(yàn)動物傷害較小，能夠連續(xù)取樣，動態(tài)監(jiān)測腦內(nèi)游離藥物濃度。此外微透析樣品較為潔凈不需要進(jìn)行樣品前處理，與HPLC、LC-MSn等技術(shù)聯(lián)用，可實(shí)現(xiàn)樣品的實(shí)時、連續(xù)、在線檢測，因此微透析技術(shù)是研究腦代謝的重要、有效手段。

4.3 LC-MSn條件優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)采用MRM掃描方式，選擇正離子模式［M＋H］＋，待測物及IS的離子響應(yīng)較好，且信號穩(wěn)定。在流動相方面，由于MDZ／1′-OH MDZ具有一定脂溶性，并且呈弱堿性，對酸敏感，在酸性條件下易出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，因此選擇乙腈和含有2 mmol·L－1乙酸銨水作為流動相。采用梯度洗脫方式，MDZ／1′-OH MDZ峰形較好，在 5 min內(nèi)即可完成一次MDZ／1′-OH MDZ的分析，并且最低定量限達(dá)0.2μg·L－1。

4.4 MDZ劑量選擇 MDZ作為CYP3A的探針?biāo)幬?，靜脈注射給藥劑量范圍為 0.5～10 mg·kg－1［10－13］，前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)股靜脈注射 MDZ劑量為1、2 mg·kg－1時，微透析液中只可檢測到 MDZ；MDZ注射劑量為5、10 mg·kg－1時，微透析液中可同時檢測到MDZ和1′-OH MDZ。由于MDZ在高劑量時具有中樞抑制作用，因此本實(shí)驗(yàn)最終選擇注射劑量為5 mg·kg－1。通過藥時曲線和藥代參數(shù)分析，MDZ可迅速跨越血腦屏障，給藥8 min微透析液即可檢出，28 min左右腦內(nèi)MDZ濃度達(dá)峰，此后迅速消除，腦內(nèi)1′-OH MDZ／MDZ轉(zhuǎn)化率約為5.75%。

此LC-MSn方法快速、靈敏，準(zhǔn)確，結(jié)合微透析技術(shù)研究大鼠腦內(nèi)MDZ／1′-OH MDZ藥代動力學(xué)特征，其腦內(nèi)藥代參數(shù)為國內(nèi)外首次報(bào)道，為深入進(jìn)行腦部代謝酶CYP3A以及藥物腦部代謝的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

［1］ Ferguson C S，Tyndale R F.Cytochrome P450 enzymes in the brain：emerging evidence of biological significance［J］.Trends Pharmacol Sci，2011，32（12）：708－14.

［2］ 李 蒙，朱傳江.CYP3A4高表達(dá)細(xì)胞模型及其應(yīng)用于藥物代謝研究進(jìn)展 ［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2012，28（1）：16－9.

［2］ Li M，Zhu C J.Advances in CYP3A4 over-expressed cell models and their application to drug metabolism research［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28（1）：16－9.

［3］ Woodland C，Huang T T，Gryz E，et al.Expression，activity and regulation of CYP3A in human and rodent brain［J］.Drug Metab Rev，2008，40（1）：149－68.

［4］ Agarwal V，Kommaddi R P，Valli K，et al.Drug metabolism in human brain：high levels of cytochrome P4503A43 in brain and metabolism of anti-anxiety drug alprazolam to its active metabolite［J］.PLoSOne，2008，3（6）：e2337.

［5］ Killer N，Hock M，Gehlhaus M，et al.Modulation of androgen and estrogen receptor expression by antiepileptic drugs and steroids in hippocampus of patients with temporal lobe epilepsy［J］.Epilepsia，2009，50（8）：1875－90.

［6］ Food and Drug Administration.Guidance for industry：drug interaction studies：study design，data analysis and recommendations for dosing and labeling recommendations（Draft Guidance）［EB／OL］.（2006－10－16）［2013-11-01］http：／／www.tebu－bio.com／upload／cms／FDADraftDDI＿guidance＿2006.pdf.

［7］ Bera R，Ahmed SK，Sarkar L，et al.Pharmacokinetic analysis and tissue distribution of andrographolide in rat by a validated LCMS／MSmethod［J］.Pharm Biol，2014，52（3）：321－9.

［8］ 楊雁芳，李 智，王 磊，等.黃芩苷及三七總皂苷配伍腦脊液藥代動力學(xué)研究 ［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2012，28（7）：1005－10.

［8］ Yang Y F，Li Z，Wang L，et al.Pharmacokinetic studies of baicalin and compatibility of baicalin-Panax Notoginsenosides in rat cerebrospinal fluid［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28（7）：1005－10.

［9］ 張群林，張?jiān)旗o，吳 亮，等.微透析－液相色譜－化學(xué)發(fā)光法測定大鼠腦組織中丹參酚類化合物濃度及其藥代動力學(xué)研究 ［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2010，26（9）：1230－7.

［9］ Zhang Q L，Zhang Y J，Wu L，et al.Determination of phenolic compounds of Salvia miltiorrhiza in rat brain by liquid chromatography with chemiluminescence detection using microdialysis sampling and application to pharmacokinetic study［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26（9）：1230－7.

［10］陳 燁，袁 瑾，王新宏，等.葛根芩連湯及不同配伍對肝細(xì)胞色素450酶的影響 ［J］.中成藥，2013，35（8）：1593－8.

［10］Chen Y，Yuan J，Wang X H，et al.Effect of gegen qinlin decoction and different synergies on liver CYP450 isofoems［J］.Chin Tradit Patent Med，2013，35（8）：1593－8.

［11］Kanazu T，Sato N，Kadono K，et al.Investigation of drug-drug interaction via mechanism-based inhibition of cytochrome P450 3A by macrolides in dexamethasone-treated female rats［J］.Biopharm Drug Dispos，2012，33（4）：195－206.

［12］Taesotikul T，Nakajima M，Tassaneeyakul W，Yokoi T.Effects of Phyllanthus amarus on the pharmacokinetics of midazolam and cytochrome P450 activities in rats［J］.Xenobiotica，2012，42（7）：641－8.

［13］趙娜萍，余露山，曾 蘇.HPLC法測定大鼠血漿中咪達(dá)唑侖的含量及其在藥物相互作用研究中的應(yīng)用［J］.藥物分析雜志，2007，27（6）：821－4.

［13］Zhao N P，Yu L S，Zeng S.HPLC determintion of midazolam in rat plasma and applied toinvestigation the drug interaction［J］.Chin J Pharm Anal，2007，27（6）：821－4.