Ｂｏｒｎａ病病毒與腦梗死后抑郁癥關(guān)系初探

牟　君　張小東　鄒德志　魏有東　周錫國　趙立波　謝　鵬　朱　丹

[摘要] 目的 檢測人類腦梗死后抑郁癥(PD)中Borna病病毒(BDV)感染率,探討B(tài)DV感染與PD的相關(guān)性。方法 采用采用巢式逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng))結(jié)合熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-nRT-PCR)檢測35例PD患者及35例健康人外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)中BDV P24基因片段。結(jié)果 35例PD患者和35例健康對照者外周血BDV P24基因片段檢測均為陰性。PD患者BDV陽性率(0)等于健康對照(0),無差異。結(jié)論 本實驗不支持BDV感染與PD的發(fā)生具有相關(guān)性。

[關(guān)鍵詞] 腦梗死后抑郁;Borna病病毒;聚合酶鏈反應(yīng)

[中圖分類號] R743.33[中圖分類號] A[文章編號] 1673-9701(2009)24-80-02

博爾納病病毒(Borna disease virus,BDV)是一種單鏈、負(fù)股、非細(xì)胞溶解性的RNA病毒[1,2],具有高度嗜神經(jīng)特點,是人畜共患病博爾納病(Borna Disease,BD)的病原體,可引起從鳥到靈長類的多種動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染[3],表現(xiàn)為以中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙為特征的BD。近年研究發(fā)現(xiàn),BDV感染與一些神經(jīng)精神疾病的發(fā)病有關(guān),尤其與精神疾病的發(fā)生[4],但有關(guān)BDV感染與腦梗死后抑郁癥(Poststroke depression,PD)發(fā)病之間的關(guān)系目前國內(nèi)外研究少有報道。本研究采用巢式逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)合熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Fluorescence quantitative nested RT-PCR,FQ-nRT-PCR),從分子生物學(xué)角度探討B(tài)DV與PD的關(guān)系,現(xiàn)將初步結(jié)果報道如下。

1資料和方法

1.1研究對象

35例病例均系重慶市南岸區(qū)PD患者,診斷均符合美國診斷與統(tǒng)計手冊第四版(DSM-Ⅳ)的診斷標(biāo)準(zhǔn),均接受抑郁癥常規(guī)治療,未接受抗病毒治療,其中男20例,女15例。35例健康對照者中男20例,女15例。兩組年齡無明顯差異(P>0.05)。

1.2主要試劑及儀器

引物序列為:①外引物:P1:5 TGACCCAACCAGTAGACCA 3(19bp)P2:5 GTCCCATTCATCCGTTGTC 3(19bp);②內(nèi)引物:P1:5 CCCTCC AAGTGGAAACCAT 3(19bp) P2:5 CAGTATCT TGATGTTCTCGCCA3(22bp);③β-actin引物P1:5 ACTCCTA CGTGGGCGACGAG3(20bp); P2: 5 CAGGTCCAGACGCAGGAT GGC 3(21bp)由上海英駿生物有限公司合成;④熒光探針:5-FAM-TCAGCGGTGCGACCACTCCGATAGC-TAMRA-3(25bp)由中山醫(yī)科大學(xué)達(dá)安基因診斷中心合成。Roter-gene3000熒光定量PCR儀(澳大利亞Corbett Research 公司)。

1.3實驗方法

參照趙立波[5]等建立的方法進(jìn)行。

RNA樣本質(zhì)量檢測和nRT-PCR結(jié)合FQ-PCR檢測BDV p24。參照徐平等[6]建立的方法進(jìn)行,并運用Roter-gene 3000熒光定量PCR儀6.0版本自動進(jìn)行實時定量分析。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理

采用SAS軟件9.0進(jìn)行Fisher精確概率檢驗。

2結(jié)果

2.1PBMCs總RNA的提取質(zhì)量

每組隨機提取4例RNA樣本用紫外分光光度計測OD260、OD280,計算OD260/OD280值。DD組OD260/OD280分別為1.86、1.85、1.96、1.92;健康對照組OD260/OD280分別為1.81、1.92、1.81、1.88。作瓊脂糖凝膠電泳顯示明顯的28S、18S、5S三條帶,說明RNA樣品純度高、完整性好、無降解。

2.2第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳

第一輪擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物作瓊脂糖凝膠電泳顯示每例樣本的β-actin的基因片斷均陽性。陰性對照顯示為陰性。說明逆轉(zhuǎn)錄和第一輪擴(kuò)增的PCR成功進(jìn)行。

2.3FQ-PCR定量結(jié)果

對第二輪擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物運用Roter-gene 3000 熒光定量PCR儀6.0版本分析軟件進(jìn)行分析。五個梯度陽性對照均擴(kuò)增成功,擴(kuò)增曲線呈S形,陰性對照無熒光量改變,其ct值和濃度對數(shù)值之間的相關(guān)系數(shù)均在0.99以上,接近1,說明循環(huán)ct值和定量濃度對數(shù)值二者之間相關(guān)性好,樣本定量較準(zhǔn)確。35例PD患者和35例健康人均為陰性(圖1)。

2.4統(tǒng)計學(xué)結(jié)果

PD組和健康對照組BDV P24基因片段陽性率均為0,兩組陽性率無差異。

3討論

研究發(fā)現(xiàn)[3],BDV是一種能引起人畜共患病BD的高度嗜神經(jīng)RNA 病毒,分布不僅包括歐洲、北美洲,還包括日本、以色列、伊朗和中國部分地區(qū),可能通過血液、唾液、尿液及糞便等途徑傳播,可引起從鳥到靈長類的多種動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染,表現(xiàn)為以精神行為異常為主要特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙。近年研究發(fā)現(xiàn)BDV可能參與包括DD、精神分裂癥、帕金森病、慢性吉蘭-巴雷綜合征、病毒性腦炎、慢性疲勞綜合征等在內(nèi)的人類神經(jīng)精神疾病的發(fā)生。國外研究者們在動物模型上已經(jīng)證實BDV感染可以通過對星形膠質(zhì)細(xì)胞功能的影響、干預(yù)HMGB 1蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、干預(yù)神經(jīng)營養(yǎng)因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)三種分子機制干預(yù)神經(jīng)元可塑性,影響腦內(nèi)神經(jīng)元的存活和發(fā)育及其功能,導(dǎo)致腦功能損害,引起宿主精神、行為的異常。眾多研究發(fā)現(xiàn),在DD急性期外周血中BDV抗原滴度明顯高于健康對照組,且與抑郁的程度具有一致性,已經(jīng)成功從DD患者PBMCs中分離出BDV,對急性期DD患者使用金剛完胺抗病毒治療療效明顯,因此有理由認(rèn)為BDV感染與DD發(fā)病有關(guān)。我們前期研究顯示重慶市南岸區(qū)存在精神疾病患者感染BDV可能[5],PD發(fā)病率高,但機制尚不清楚。關(guān)于PD與BDV感染的關(guān)系研究報道少有。本研究運用FQ-nRT-PCR檢測PD患者和健康人PBMCs中BDV P24基因片段,結(jié)果35例PD患者均為陰性,35例健康人亦均為陰性,兩組陽性率為0(0/35),無差異。本實驗不支持BDV與PD的發(fā)生具有相關(guān)性。雖本實驗所采用方法FQ-nRT-PCR的特異性和敏感性均較一般的RT-PCR方法高,但因本實驗中樣本量相對較少,不能排除BDV感染與PD的發(fā)生具有相關(guān)性,有待增加樣本量加以進(jìn)一步的研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] BrieseT, Dela Torre JC. Borna disease virus,a negative-strand RNA virus, transcribes in the nucleus of infected cells[J]. ProcNatl AcadSciUSA,1992,89:11486-11489.

[2] Cubitt B,OldstoneC,Dela TorreJC,et al. Sequence and genome organization of Borna disease virus J[J]. Virol,1994,68:1382-1396.

[3] Staeheli P, Sauder C, Hausmann J, et al. Epidemiology of Borna disease virus[J]. J Gen Virol,2000,81(9):2123.

[4] Thomas DR,Chalmers RM,Crook B,et al. Borna disease virus and mental health: a cross-sectional study[J]. QJM,2005,98(4):247.

[5] 趙立波,謝鵬,李亞軍,等. 精神分裂癥患者血液標(biāo)本檢測博爾納病病毒核酸[J]. 中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2006,26(12):1101.

(收稿日期:2009-03-16)