乳腺癌患者Ki-67表達(dá)水平對(duì)新輔助化療后病理學(xué)完全緩解的預(yù)測(cè)價(jià)值

劉杰娜，張建國(guó)，郭寶良，陳晰，于璽文，王卓眾，柳林

（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 乳腺外科，黑龍江 哈爾濱150081）

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。國(guó)際抗癌協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)資料表明，歐美國(guó)家乳腺癌已經(jīng)成為威脅女性生命健康的頭號(hào)殺手。雖然目前我國(guó)乳腺癌發(fā)病率與西方相比相對(duì)較低，但近年來(lái)以每年3%的速度遞增，增速較快[1]。2015年我國(guó)乳腺癌新發(fā)人數(shù)預(yù)計(jì)將達(dá)女性新發(fā)腫瘤的15%，為268 600人，居女性惡性腫瘤首位，而病死數(shù)達(dá)69 500人[2]。新輔助化療（neoadjuvant chemotherapy，NAC）作為乳腺癌的治療策略現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床，是局部晚期乳腺癌或炎性乳腺癌的規(guī)范療法：第一，可使腫瘤降期以利于手術(shù)，變不可手術(shù)為可手術(shù)乳腺癌；第二，對(duì)于腫瘤較大且有保乳意愿的患者可提高保乳率；第三，是評(píng)估腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物敏感性的有效手段[3-4]。但約3%的患者在NAC過(guò)程中可能出現(xiàn)病情進(jìn)展，甚至喪失手術(shù)機(jī)會(huì)[5]。文獻(xiàn)[6-9]證實(shí)，接受NAC的乳腺癌患者，若能達(dá)到病理學(xué)完全緩解（pathological complete response，pCR），則預(yù)示較好的遠(yuǎn)期效果。傳統(tǒng)的影像學(xué)技術(shù)、腫瘤形態(tài)等并不能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)NAC療效。因此，臨床上需要一個(gè)敏感性和特異性高的指標(biāo)來(lái)評(píng)估和預(yù)測(cè)NAC療效。

Ki-67是可通過(guò)病理學(xué)免疫組化方法進(jìn)行測(cè)定的腫瘤指標(biāo)，是除G0期外，可在細(xì)胞增殖的各個(gè)階段進(jìn)行表達(dá)的核蛋白，代表腫瘤細(xì)胞的增殖速度。研究[10-13]表明，Ki-67表達(dá)水平可能與乳腺癌NAC療效及預(yù)后存在一定的相關(guān)性。pCR是NAC的主要病理觀測(cè)指標(biāo)，pCR的定義有兩種：⑴ 一般是指乳腺原發(fā)灶中找不到惡性腫瘤的組織學(xué)證據(jù)，或僅存在原位癌成分；⑵ 嚴(yán)格意義上是指乳腺原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移的區(qū)域淋巴結(jié)均達(dá)到pCR[14]。本研究中pCR的定義采用第一種標(biāo)準(zhǔn)，病理標(biāo)本由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院病理科2名病理科醫(yī)師獨(dú)立盲目閱片完成，通過(guò)分析行NAC患者的臨床病理資料，探討Ki-67水平和PR表達(dá)情況對(duì)NAC療效（pCR）的預(yù)測(cè)價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2011年11月—2015年11月哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院乳腺外科收治的行NAC且臨床病理資料較為完整的乳腺癌患者261例。納入標(biāo)準(zhǔn)：化療前經(jīng)粗針穿刺取得病理和免疫組化結(jié)果，病理類型均為浸潤(rùn)性癌；根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（American Joint Committee on Cancer，AJCC）第7版TNM分期標(biāo)準(zhǔn)[15]，臨床分期為II～I(xiàn)II期可進(jìn)行NAC的患者；美國(guó)東部腫瘤協(xié)作組（Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG）體能狀態(tài)評(píng)分為0～2分。排除標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)系統(tǒng)檢查發(fā)現(xiàn)有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；NAC前曾進(jìn)行其他抗腫瘤治療；NAC前有器官移植病史或其他影響重要器官功能障礙的重大疾病史。所有患者的臨床一般資料包括腫瘤的臨床大小、淋巴結(jié)狀態(tài)，治療方案，受體狀態(tài)均記錄相對(duì)完整。入組患者基本情況：平均年齡（49.2±9.4）歲；病理類型：浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌251例，浸潤(rùn)性小葉癌10例；手術(shù)方式：乳腺癌改良根治術(shù)241例，保留乳房的乳腺癌切除術(shù)20例。

1.2 治療方案

術(shù)前NAC方案：TEC（多西他賽75 mg/m2+表柔比星60 mg/m2，d1+環(huán)磷酰胺500 mg/m2，第1天），TE（多西他賽75mg/m2+表柔比星75 mg/m2，第1天）和TCH方案[多西他賽75 mg/m2+卡鉑血藥濃度設(shè)為曲線下面積（AUC）6，第1天，曲妥珠單抗首劑8 mg/kg，第1天，隨后6 mg/kg 21 d]，所有化療方案每21天為1個(gè)療程。 患者術(shù)前均接受了≥4個(gè)療程的NAC。術(shù)前未完成全部NAC療程的患者，術(shù)后繼續(xù)完成剩余化療療程，后續(xù)治療方案包括放療、靶向治療、內(nèi)分泌治療等均按照美國(guó)國(guó)家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology v.2）指南進(jìn)行[16]。

1.3 乳腺癌分子標(biāo)記物

采 用免疫組化SP法測(cè)定雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、Ki-67表達(dá)及表皮生長(zhǎng)因子受體2（Her-2）狀態(tài)。所有檢測(cè)標(biāo)本均用中性甲醛固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，實(shí)驗(yàn)步驟按常規(guī)免疫組化步驟進(jìn)行，ER、PR和Ki-67的陽(yáng)性表達(dá)均定為在細(xì)胞核，有彌漫性或者深淺各異的棕黃色顆粒記為陽(yáng)性，Her-2主要定為在細(xì)胞膜，在細(xì)胞膜內(nèi)發(fā)現(xiàn)棕黃色顆粒則記為陽(yáng)性，上述指標(biāo)單克隆抗體及免疫組化試劑盒均購(gòu)自上?；蚩萍加邢薰?，所有標(biāo)本切片染色后結(jié)果判定由兩位病理科醫(yī)生通過(guò)雙盲法進(jìn)行，在400倍高倍鏡下每張切片隨機(jī)選取5個(gè)代表性區(qū)域，每個(gè)高倍鏡視野計(jì)數(shù)鏡下所有腫瘤細(xì)胞，計(jì)數(shù)陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞占所有腫瘤細(xì)胞的百分比。ER、PR陽(yáng)性定義：≥1%的腫瘤細(xì)胞核著色，經(jīng)免疫組織化學(xué)檢測(cè)Her-2為（++）的患者應(yīng)進(jìn)一步做熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）、顯色原位雜交（chromogenic in situ hybridization，CISH）或重復(fù)免疫組化檢測(cè)明確是否有基因擴(kuò)增。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0（IBM，Bethesda，MD，USA）軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)部分臨床信息不明確的情況，在統(tǒng)計(jì)分析中按缺失值進(jìn)行處理。不同臨床病理因素之間pCR的比較采用χ2檢驗(yàn)；采用多因素Logistic回歸分析方法分析各因素對(duì)pCR表達(dá)的影響，找出影響pCR表達(dá)的獨(dú)立預(yù)測(cè)因 子；此外，采用ROC曲線下面積（AUC）評(píng)估Ki-67對(duì)NAC療效的預(yù)測(cè)價(jià)值，并通過(guò)Youden指數(shù)對(duì)最佳截?cái)嘀档拿舾行院吞禺愋赃M(jìn)行了評(píng)估，分析計(jì)算Ki-67最佳截?cái)嘀禐?0%。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Ki-67預(yù)測(cè)pCR的ROC曲線

K i-6 7表達(dá)與 p C R呈正相關(guān)，在所有患者中，以Ki-67為指標(biāo)的ROC曲線下面積（AUC）為0.7092（圖1A），在ER陽(yáng)性乳腺癌患者中，以Ki-67為指標(biāo)的AUC為0.7312（圖1B），提示在ER陽(yáng)性患者中，Ki-67的潛在診斷價(jià)值可能更高。采用AUC評(píng)估Ki-67對(duì)NAC療效的預(yù)測(cè)價(jià)值，并通過(guò)Youden指數(shù)對(duì)最佳截?cái)嘀档拿舾行院吞禺愋赃M(jìn)行了評(píng)估。分析計(jì)算得出本研究Ki-67預(yù)測(cè)pCR的最佳截?cái)嘀禐?0%，隨之將患者分為Ki-67高水平組（Ki-67＞50%）和Ki-67低水平組（Ki-67≤50%）。

圖1 Ki-67預(yù)測(cè)pCR的ROC曲線 A：全組患者；B：ER陽(yáng)性患者Figure 1 ROC curves of Ki-67 for predicting pCR A: Whole group of patients; B: ER positive patients

2.2 NAC療效與臨床病理因素關(guān)系

本研究共261例患者入組，41例（15.7%）獲得了pCR（表1）。單因素分析中，pCR與PR、Her-2狀態(tài)、分子分型和Ki-67水平明顯有關(guān)（均P＜0.05）；pCR與年齡、腫瘤大小、原始腋窩淋巴結(jié)狀態(tài)、ER無(wú)關(guān)（均P＞0.05）（表1），其中：PR陽(yáng)性患者pCR率（14.9%）明顯低于PR陰性者（18.5%）；Her-2陽(yáng)性患者pCR率（23.0%）明顯高于Her-2陰性者（12.8%），Her-2陽(yáng)性患者中，未進(jìn)行曲妥珠單抗治療組pCR率（20.97%）低于進(jìn)行曲妥珠單抗治療組（33.3%）；HR陽(yáng)性患者（ER和PR均陽(yáng)性）pCR率（11.0%） 明顯低于三陰性乳腺癌（TNBC）患者（21.9%）；Ki-67高水平患者pCR率（32.9%）明顯高于Ki-67低水平者（8.1%）。在多因素變量Logistic回歸分析中，僅Ki-67進(jìn)入了多因素模型，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。因此，Ki-67表達(dá)水平是pCR的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，Ki-67高水平患者的pCR率是Ki-67低水平的5.476倍（OR=5.476，95%CI=2.637～11.372）（表2）。

表1 NAC療效與乳腺癌患者臨床病理因素關(guān)系的單變量分析Table 1 Univariate analysis of relations of NAC efficacy with clinicopathologic factors of breast cancer patients

表2 乳腺癌患者pCR影響因素的多變量Logistic回歸分析Table 2 Multivariate Logistic regression analysis of Influential factors for pCR in breast cancer patients

本研究共196例ER陽(yáng)性患者入組，其中29例（14.8%）獲得了pCR（表3）。分析結(jié)果顯示，在ER陽(yáng)性患者亞組中，Ki-67高水平，PR陽(yáng)性和Her-2陽(yáng)性是pCR的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。其中：PR陽(yáng)性患者的pCR率（10.4%）明顯低于PR陰性者（37.5%） ；Ki-67高水平患者pCR率（35.3%）明顯高于Ki-67低水平者（7.6%）；Her-2陽(yáng)性患者的pCR率（27.3%）明顯高于Her-2陰性者（11.2%）。在多因素Logistic回歸分析中顯示：PR陽(yáng)性者的pCR率是PR陰性者的0.303倍（OR=0.303，95%CI=0.113～0.810）；Her-2陽(yáng)性者的pCR率是Her-2陰性者的2.607倍（OR=2.607，95%CI=1.023～6.642）；Ki-67高水平者pCR率是Ki-67低水平者的4.282倍（OR=4.282，95%CI=1.694～10.825）（表4）。

表3 NAC療效與ER陽(yáng)性乳腺癌患者臨床病理因素關(guān)系的單變量分析Table 3 Univariate analysis of relations of NAC efficacy with clinicopathologic factors of ER positive breast cancer patients

表4 ER陽(yáng)性乳腺癌患者pCR影響因素的多變量Logistic回歸分析Table 4 Multivariate Logistic regression analysis of Influential factors for pCR in ER positive breast cancer patients

3 討 論

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，極大威脅著女性的身心健康。乳腺癌是一種異質(zhì)性疾病，個(gè)體化治療在乳腺癌的臨床治療中具有越來(lái)越重要的意義。乳腺癌的綜合治療包括手術(shù)、放療、化療、內(nèi)分泌治療、靶向治療等，NAC為臨床綜合治療多種惡性疾病的重要部分，通過(guò)NAC，可以有效提高腫瘤手術(shù)完全切除率，延長(zhǎng)生存周期。NAC的療效預(yù)測(cè)指標(biāo)對(duì)指導(dǎo)乳腺癌的個(gè)體化治療和預(yù)測(cè)預(yù)后具有特殊重要的意義。

Ki-67是目前最常用的反應(yīng)細(xì)胞增殖狀況的標(biāo)記，與腫瘤的發(fā)生、浸潤(rùn)種植和轉(zhuǎn)移過(guò)程相關(guān)，在乳腺癌中，腫瘤細(xì)胞Ki-67的表達(dá)被認(rèn)為與細(xì)胞核分級(jí)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，有絲分裂率等密切相關(guān)，Ki-67陽(yáng)性表達(dá)率越高，反映腫瘤細(xì)胞增殖活性強(qiáng)，惡性程度高，患者預(yù)后差，NAC療效評(píng)價(jià)系統(tǒng)主要為MP系統(tǒng)、殘余腫瘤負(fù)荷等指標(biāo)，但這些評(píng)價(jià)系統(tǒng)應(yīng)用于NAC后手術(shù)切除病理，而Ki-67在術(shù)前穿刺病理中即可方便獲得，探究NAC前穿刺病理Ki-67水平來(lái)預(yù)測(cè)NAC效果，對(duì)臨床有較大指導(dǎo)意義。既往文獻(xiàn)[17-21]報(bào)道，Ki-67是NAC療效的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，Ki-67高表達(dá)患者對(duì)化療更敏感，Ki-67高水平可能預(yù)示著預(yù)后較差。許多研究已經(jīng)對(duì)Ki-67是否可以作為乳腺癌的預(yù)后指標(biāo)來(lái)進(jìn)行分析[22]。Fasching等[23]得出Ki-67截?cái)嘀刀x為＞13%時(shí)，Ki-67水平是PCR的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素，Ki-67高水平被認(rèn)為是總生存（overall survival，OS）和遠(yuǎn)處無(wú)病生存（distant disease free survival，DDFS）的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，但遺憾的是，本研究不包括隨訪資料，因此未進(jìn)行生存分析。

關(guān)于乳腺癌NAC的經(jīng)典試驗(yàn)（NSABP B-18研究、NSABP B-27研究、EORTC 10994/BIG 1-00研究、NOAH研究）顯示NAC與術(shù)后化療的乳腺癌患者的DFS和OS差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但NAC能顯著提高乳腺癌患者的保乳手術(shù)率，而且亞組分析顯示：NAC獲得pCR的乳腺癌患者較未獲得pCR的患者DFS、OS得到顯著改善，提示腫瘤對(duì)NAC的反應(yīng)可以作為預(yù)測(cè)患者預(yù)后的指標(biāo)，然而NAC的臨床療效受到諸多因素的影響，不同患者對(duì)化療的敏感性及預(yù)后存在較大差異。在大樣本隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)中的pCR率從5%到29%不等，如NSABP B-18研究，NAC方案為AC（多柔比星60 mg/m2+環(huán)磷酰胺500 mg/m2，第1天），pCR率為13%，NSABP B-2 7研究，N A C方案為A C序貫T（多柔比星60 mg/m2+環(huán)磷酰胺500 mg/m2+序貫多西他賽100 mg/m2，第1天），pCR率為26%[24-25]。但NSABP B-18和NSABP B-27研究并沒(méi)有涉及乳腺癌患者的激素受體及Her-2表達(dá)情況的分析。本研究的pCR率為15.7%，與之前的研究結(jié)果類似。EORTC 10994/BIG 1-00研究說(shuō)明不同分子亞型對(duì)NAC的療效反應(yīng)不同，激素受體陽(yáng)性患者進(jìn)行NAC很難獲得pCR，而Her-2陽(yáng)性和TNBC患者可獲得更佳的pCR[25]，在本研究中，三陰性乳腺癌（TNBC）患者的pCR率（21.9%）與先前研究所公布的pCR率（22%～58%）結(jié)果相近[26-27]。NOAH研究表明加用曲妥珠單抗的NAC能顯著提高Her-2陽(yáng)性乳腺癌患者的pCR率[28]。本研究中，Her-2陽(yáng)性亞組pCR率（20.97%未進(jìn)行曲妥珠單抗治療組vs.33.3%進(jìn)行曲妥珠單抗治療組）與NOAH研究（19%vs.38%）[28]和其他研究[29-30]結(jié)果類似。

本研究對(duì)Ki-67的最佳截?cái)嘀颠M(jìn)行了評(píng)估。先前研究中常以Ki-67截?cái)嘀禐?4%或20%將激素受體陽(yáng)性患者被分為L(zhǎng)uminal A和Luminal B組，但該截?cái)嘀挡荒茏鳛轭A(yù)測(cè)腫瘤對(duì)NAC反應(yīng)的最佳值。本研究依據(jù)我科室NAC患者臨床病理資料及NAC療效，通過(guò)計(jì)算ROC的AUC得出Ki-67水平的最佳截?cái)嘀禐?0%。在以前的研究中，HR陽(yáng)性，TNBC和Her-2陽(yáng)性亞型組的最佳截?cái)嘀捣秶謩e為36%～40%，30%～40%和17%～20%[23]。然而，在本研究中存在許多影響pCR率的相關(guān)因素。首先，Her-2陽(yáng)性患者接受靶向治療更易獲得pCR，但由于經(jīng)濟(jì)原因，很少有患者選擇含靶向治療的NAC方案。因此，在這些患者中很難獲得關(guān)于Ki-67最佳截?cái)嘀档臏?zhǔn)確數(shù)據(jù)。其次，通常TNBC患者pCR率較高，但本研究中TNBC患者入組較少，因此在一些特定患者中，Ki-67的最佳截?cái)嘀悼赡芷x參考值。

本研究得出，Ki-67是pCR的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，Ki-67高表達(dá)患者與pCR率高；在ER陽(yáng)性亞組中，PR陽(yáng)性患者與pCR率低，Ki-67水平和PR狀態(tài)可作為預(yù)測(cè)NAC的療效的分子指標(biāo)，對(duì)于個(gè)體化NAC有一定臨床指導(dǎo)價(jià)值，但是本研究也有一些不足之處：研究類型屬于回顧性研究且入組患者人數(shù)較少，今后需開(kāi)展前瞻性、隨機(jī)和多中心研究進(jìn)一步明確Ki-67表達(dá)水平和PR表達(dá)情況對(duì)NAC療效及預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值。

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