ＣＸＣＬ１６與動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系研究

呂永青　卜培莉

【摘要】 目的 探討CXCL16與動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系。

方法 對所有參與者進(jìn)行頸動(dòng)脈超聲檢查，分為頸動(dòng)脈斑塊組和健康組，同時(shí)經(jīng)隔夜禁食后，次日清晨抽取肘靜脈抗凝血5 ml，分離單個(gè)核細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法檢測外周血單個(gè)核細(xì)胞CXCL16及其受體CXCR6基因表達(dá)情況。結(jié)果 頸動(dòng)脈斑塊組比健康組CXCL16及其受體CXCR6基因表達(dá)水平(△Ct26.85±5.04,21.77±4.02;25.30±7.00,20.00±4.48)顯著增高（P<0.001） 。結(jié)論 CXCL16是動(dòng)脈硬化發(fā)生的危險(xiǎn)因子。

【關(guān)鍵詞】動(dòng)脈粥樣硬化；CXCL16

To research the relationship between CXCL16 and atherosclerosis

LV Yong-qing,BU Pei-li.Changhong Hospital in Jinan,Shandong 250063,China

【Abstract】 Objective To research the relationship between CXCL16 and atherosclerosis.

Methods In this study,we recruited 60 consecutive subjects with 30 carotid arteries plaque and 30 age-and-sex-matched normal subjects,fasting blood sample was collected from each subjects after 12-14 hours fast.Monocytes in the peripheral blood were isolated，the expression of cxcl16/cxcr6 mRNA were compared using RT-PCR，with beta-actin as internal control.Results The expression of cxcl16/cxcr6 mRNA in the monocytes was significantly higher in plaque patients than in normal subjects(P<0.001）.Conclusion Cxcl16 is a dangerous factor in atherosclerosis.

【Key words】Atherosclerosis; CXCL16

目前研究認(rèn)為，動(dòng)脈粥樣硬化是一種炎癥性疾病，炎癥反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起到非常重要的作用［1］。 而趨化因子是聯(lián)系炎癥及動(dòng)脈硬化的樞紐［2］。

除了脂質(zhì)沉浸和血管平滑肌細(xì)胞增殖，單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞浸潤也是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成各個(gè)階段的重要特征，單個(gè)核細(xì)胞持續(xù)的募集到血管壁是動(dòng)脈硬化形成的關(guān)鍵步驟，越來越多的證據(jù)表明［3］趨化因子參與了此過程，并通過激活和引導(dǎo)免疫細(xì)胞到達(dá)動(dòng)脈硬化斑塊，而發(fā)揮其作用。

本研究應(yīng)用高分辨率外周血管超聲技術(shù),檢測頸動(dòng)脈結(jié)構(gòu)和功能的改變。同時(shí)應(yīng)用實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法檢測外周血單個(gè)核細(xì)胞CXCL16及其受體CXCR6基因表達(dá)情況。 以期發(fā)現(xiàn)CXCL16與動(dòng)脈硬化的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 研究對象 本研究所有參與者均來自本院門診及住院患者，選取60例進(jìn)行病例對照研究。其中30例均經(jīng)頸部超聲檢查有斑塊，30例健康人為對照組(無高血壓、糖尿病、腹型肥胖、血脂紊亂及其他炎性反應(yīng)、免疫性疾病)。兩組性別和年齡差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 主要儀器 ①GE ViVid7彩超:美國通用電氣公司生產(chǎn)；

②PCR核酸擴(kuò)增儀：GeneAmp PCR System9700型，美國ABI公司產(chǎn)品，山東大學(xué)心血管病研究中心提供；

③高速離心機(jī)：TGL-16型，上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)，山東大學(xué)心血管病研究中心提供；④ABI 7500 RT-PCR儀：山東大學(xué)心血管病研究中心提供。

1.3 主要試劑 ①淋巴細(xì)胞分離液；②白細(xì)胞裂解液；③TriZOL；④氯仿；⑤異丙醇。

1.4 研究方法

1.4.1 頸動(dòng)脈超聲檢查 受檢者取仰臥位，頸下墊薄枕，頭部偏向檢查對側(cè)，充分暴露頸部，依次檢查右側(cè)和左側(cè)頸動(dòng)脈,記錄頸動(dòng)脈長軸和短軸圖像，觀察頸動(dòng)脈內(nèi)膜是否光滑、有無增厚、斑塊部位、斑塊大小和回聲特點(diǎn)。

1.4.2 頸動(dòng)脈超聲測量指標(biāo) ①頸動(dòng)脈內(nèi)徑； ②頸動(dòng)脈IMT；③斑塊指數(shù)(plaqueindex)。

1.4.3 外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離 取抗凝血約5 ml，用生理鹽水稀釋1倍，將稀釋后的血液沿管壁加于淋巴細(xì)胞分離液上，避免血液沖入分離液，稀釋血與分離液的柱高之比為3∶2~2∶1，然后置于水平離心機(jī)，2 500轉(zhuǎn)/min×25 min,離心后，將試管中的第二層白膜層，用管口細(xì)而平的毛細(xì)吸管輕輕插入，吸出置于離心管中，加5倍體積的生理鹽水于離心管中，離心，2 000轉(zhuǎn)/min×10 min,棄上清，用生理鹽水重懸細(xì)胞，與上相同離心2次，棄上清，將管底細(xì)胞搖勻，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 RT-PCR 將每個(gè)裝有PBMC的EP管加入1 ml白細(xì)胞裂解液，混勻，加200 μl氯仿顛倒混勻，離心，12 000轉(zhuǎn)/min×10 min，緩慢吸上清至一新EP管，再加等體積異丙醇顛倒混勻，離心，15 000轉(zhuǎn)/min×10 min，去上清，加入1 ml無水乙醇，離心，15 000轉(zhuǎn)/min×10 min，按RNA量溶解，0.5~1.0 μg/ml,然后，分別加入相關(guān)試劑，進(jìn)入RT和PCR反應(yīng)體系。按軟件程序進(jìn)行分析，得出相關(guān)的△Ct值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (x±s)表示，兩組間參數(shù)比較采用兩組獨(dú)立樣本資料的t檢驗(yàn) 。采用SPSS 16.0 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對照組與斑塊組頸動(dòng)脈超聲指標(biāo)的比較 與對照組相比，斑塊組平均IMT、最大IMT、Ds、Dd、斑塊指數(shù)明顯升高 (P<0.001)(表1)。

2.2 對照組與斑塊組外周血PBMC CXCL16及其受體CXCR6基因表達(dá)情況的比較; 與對照組相比，斑塊組CXCL16及其受體CXCR6基因表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。(表2)。

3 討論

趨化因子是一組具有趨化作用的細(xì)胞因子，能吸引免疫細(xì)胞到達(dá)免疫應(yīng)答局部，參與免疫調(diào)節(jié)和免疫病理反應(yīng)。CXCL16是近年在人的動(dòng)脈硬化損傷部位的巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種趨化因子，同時(shí)也是一種膜結(jié)合蛋白［8］。CXCL16在T細(xì)胞的遷移中起重要作用［4］。血管內(nèi)皮細(xì)胞同時(shí)表達(dá)功能性地分泌型CXCL16和膜結(jié)合性CXCL16分子［9］，分泌型CXCL16參與激活T淋巴細(xì)胞趨化，膜結(jié)合型CXCL16作為粘附分子，通過它的趨化因子活性區(qū)參與活化T淋巴細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的識別和直接黏附，促進(jìn)大量的特異性炎性細(xì)胞浸潤。趨化因子通過與相應(yīng)受體結(jié)合而發(fā)揮作用。目前已知的趨化因子受體中只有CXCR6對CXCL16配體發(fā)生功能性應(yīng)答，是CXCL16的惟一受體［5］。其主要在T細(xì)胞、B細(xì)胞、NKT細(xì)胞及DC中表達(dá)，趨化試驗(yàn)顯示，只有高表達(dá)Cxcr6的細(xì)胞才能發(fā)生對CXCL16的趨化應(yīng)答［10］。

CXCL16/SR-PSOX參與了AS斑塊形成的炎性反應(yīng)和免疫學(xué)說，可能在人類動(dòng)脈粥樣硬化性疾病中發(fā)揮前炎癥因子的作用，歸結(jié)起來可能有3個(gè)方面的病理生理功］：①結(jié)合并吞噬ox-LDL,參與了AS細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)聚集,促進(jìn)巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞形成泡沫細(xì)胞；②強(qiáng)烈趨化激活CD8+T細(xì)胞。有學(xué)者推測，CD8+T細(xì)胞的激活會(huì)導(dǎo)致AS斑塊部位細(xì)胞的調(diào)亡，殺傷平滑肌細(xì)胞；促使效應(yīng)性T細(xì)胞定向遷移至AS病變處，這是在動(dòng)脈硬化前炎性反應(yīng)發(fā)展中的重要一步；③作為血管源性因子，CXCL16/SR-PSOX可以顯著誘導(dǎo)血管形成，可能促進(jìn)斑塊的發(fā)生、發(fā)展，甚至誘發(fā)斑塊出血和斑塊破裂，成為在動(dòng)脈硬化性疾病中的核心事件。

Minami等對動(dòng)脈粥樣硬變和無病變動(dòng)脈進(jìn)行CXCL16/SR-PSOX mRNA檢測,發(fā)現(xiàn)CXCL16/SR-PSOX mRNA高度表達(dá)在粥樣硬化斑塊內(nèi),而在正常動(dòng)脈內(nèi)膜未檢出其表達(dá),免疫組化也顯示CXCL16/SR-PS/X顯著表達(dá)于粥樣硬化斑塊的血管內(nèi)膜巨噬細(xì)胞上；以高脂飲食喂養(yǎng)的敲除ApoE鼠的斑塊病變處也有CXCL16/SR-PSOX大量存在。另外研究表明，干擾素-γ、激活的T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子上調(diào)CXCL16/SR-PSOX，已證實(shí)CXCL16/SR-PSOX在AS斑塊的免疫炎癥反應(yīng)中起正反饋?zhàn)饔谩?/p>

本研究對頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊組與健康人進(jìn)行了頸動(dòng)脈結(jié)構(gòu)的超聲檢查，發(fā)現(xiàn)斑塊組頸動(dòng)脈結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著的變化，表現(xiàn)為IMT增厚、斑塊指數(shù)增大、管徑擴(kuò)大。同時(shí)對其外周血單個(gè)核細(xì)胞CXCL16、Cxcr6 mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)頸動(dòng)脈斑塊組比健康組CXCL16及其受體Cxcr6基因表達(dá)水平顯著增高（P<0.001）。

總之,CXCL16在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用毋庸置疑,但確切的生理功能還有待進(jìn)一步研究,努力探索CXCL16的功能和發(fā)病機(jī)制,在動(dòng)脈硬化性疾病的防治中可能具有重要意義。

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