基因定位技術(shù)在遺傳病診斷中的應(yīng)用

李凌春

[摘要] 熒光PCR定量技術(shù)(Quantitative PCR)是一種新興的基因定位技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)靈敏、簡(jiǎn)便、快速、不需使用放射性同位素，PCR完成后，通過(guò)測(cè)序儀的自動(dòng)識(shí)別即可對(duì)待測(cè)DNA進(jìn)行定量分析。在遺傳病，特別是一些以大片段缺失為主要突變類型的遺傳病診斷中，熒光PCR定量技術(shù)發(fā)揮了很重要的作用。

[關(guān)鍵詞] 熒光PCR定量技術(shù)；基因定位技術(shù)；遺傳病

[中圖分類號(hào)] R394-3[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]C [文章編號(hào)]1674-4721（2009）05（a）-016-02

在早期的遺傳學(xué)分子診斷中，主要依賴于Southern Blotting，寡核苷酸雜交等技術(shù)。自1985年Saiki等首次描述聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)以來(lái)，PCR技術(shù)因?yàn)槠潇`敏特異，省時(shí)省力等諸多優(yōu)點(diǎn)而受到了人們的高度重視，已經(jīng)應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)和化學(xué)等基礎(chǔ)研究的各個(gè)領(lǐng)域，并且成為醫(yī)學(xué)臨床和法醫(yī)學(xué)研究的強(qiáng)有力分析工具之一[1-3]。然而，近幾年來(lái)，研究者們不再滿足于得知某一特異DNA序列的存在與否，他們更著眼于對(duì)其進(jìn)行精確的核酸定量。盡管把PCR作為一種定量的工具，在技術(shù)上還面臨著一些挑戰(zhàn)。熒光PCR基因定位技術(shù)是近十余年來(lái)興起的一種分子生物學(xué)技術(shù)，與其他定量方法相比，具有靈敏、簡(jiǎn)便、快速、不需使用放射性同

位素的特點(diǎn)，在基因表達(dá)、傳染病和遺傳病的診斷等方面迅速得到了廣泛應(yīng)用。

1 熒光PCR基因定位技術(shù)的原理

熒光PCR定量技術(shù)的主要原理為：在PCR前，通過(guò)化學(xué)方法在引物的5端通過(guò)共價(jià)方式連接一個(gè)熒光分子。由于在進(jìn)行PCR時(shí)，引物和待擴(kuò)增模板5端的堿基不需要完全匹配，熒光PCR引物和普通PCR引物一樣，能夠?qū)Υ郎y(cè)模板進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增。擴(kuò)增完成后，根據(jù)PCR的產(chǎn)量，將熒光PCR產(chǎn)物直接或按一定比例稀釋后，和內(nèi)標(biāo)、載樣緩沖液混合，在自動(dòng)測(cè)序儀上進(jìn)行電泳。在自動(dòng)測(cè)序儀內(nèi)激光的激發(fā)下，PCR產(chǎn)物上的熒光分子發(fā)出固定波長(zhǎng)的激發(fā)光，被儀器內(nèi)的光電管捕獲。根據(jù)PCR產(chǎn)物從開(kāi)始電泳到經(jīng)過(guò)光電管的時(shí)間，測(cè)序儀自動(dòng)計(jì)算出相應(yīng)產(chǎn)物的實(shí)際堿基數(shù)。不同泳道之間電泳速度的差別，通過(guò)各產(chǎn)物內(nèi)混合的內(nèi)標(biāo)校正。同時(shí)，測(cè)序儀也自動(dòng)標(biāo)出相應(yīng)產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度，該數(shù)值就是熒光PCR定量技術(shù)對(duì)模板進(jìn)行定量與定位的基礎(chǔ)。與非定量PCR分析方法不同，熒光PCR的操作程序有助于評(píng)估污染的情況，即測(cè)出污染的程度，即使陰性對(duì)照產(chǎn)生了正的信號(hào)，只要這些信號(hào)比實(shí)驗(yàn)樣品的低得多，依據(jù)這樣的結(jié)果，至少可以推測(cè)出實(shí)驗(yàn)中所得出的信號(hào)是真實(shí)的[4-6]。在一定程度上，熒光PCR消除了普通PCR過(guò)于敏感、假陽(yáng)性率高的缺點(diǎn)。熒光PCR常用于研究發(fā)病機(jī)制、估計(jì)病毒的負(fù)荷量、監(jiān)測(cè)臨床治療進(jìn)展或用于診斷遺傳缺陷等。通過(guò)對(duì)靶基因量的檢測(cè)，將其與疾病的臨床表現(xiàn)、臨床分型以及各種標(biāo)志酶的值聯(lián)系起來(lái)，為疾病的診斷和藥物治療監(jiān)測(cè)提供科學(xué)的依據(jù)。目前，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于多種遺傳病的診斷和產(chǎn)前篩查，如地中海貧血、兒童型脊肌萎縮癥、杜氏/貝氏肌營(yíng)養(yǎng)不良、胖骨肌萎縮癥和各種染色體病等。

2 熒光PCR基因定位技術(shù)在遺傳病診斷中的應(yīng)用

2.1 在α地中海貧血中的診斷作用

1988年，Chehab用兩對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增α珠蛋白和β珠蛋白基因，并在這兩對(duì)引物上分別標(biāo)記上羅丹明和熒光素。在紫外線的照射下，羅丹明產(chǎn)生紅色熒光而熒光素產(chǎn)生綠色熒光。在同一循環(huán)條件下PCR完成后，通過(guò)離心將擴(kuò)增產(chǎn)物和游離引物分離，根據(jù)擴(kuò)增后產(chǎn)物顏色直接判斷基因的缺失情況[7]。如產(chǎn)物為桔紅色，則說(shuō)明α和β珠蛋白基因都得了擴(kuò)增。如果產(chǎn)物為綠色，說(shuō)明α珠蛋白基因缺失，只有顯綠色熒光的β珠蛋白基因得到了擴(kuò)增。

2.2 在DMD/BMD中的應(yīng)用

DMD/BMD(杜氏/貝氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥)是最常見(jiàn)的致死性神經(jīng)肌肉遺傳病。在男性中，其患病率約為1/3 500，為x連鎖隱性遺傳，其中73%為缺失或重復(fù)突變，新生突變占所有患者的30%。由于x染色體的隨機(jī)失活比例不同，約40%的DMD攜帶者不能通過(guò)血清CPKH活性診斷。1992年，schwartz將熒光PCR應(yīng)用于該病的攜帶者診斷。他們采用熒光引物和測(cè)序儀分析位于肌營(yíng)養(yǎng)不良基因內(nèi)部的4對(duì)CA重復(fù)序列。測(cè)序儀可以鑒別2個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)度的差異，能夠?yàn)檫B鎖分析提供更多的信息[8]。在以下情況時(shí)，連鎖分析有時(shí)不足以對(duì)攜帶者進(jìn)行判斷：①CA重復(fù)不能提供信息，②家族成員不全，③新生突變或者嵌合體造成的連鎖分析失效，因此，他們還采用熒光PCR直接擴(kuò)增肌營(yíng)養(yǎng)不良基因外顯子，并用測(cè)序儀定量分析產(chǎn)物，將結(jié)果和連鎖分析一起作為判斷攜帶者的依據(jù)。通過(guò)以上方法，他們對(duì)43名可疑攜帶者進(jìn)行了診斷。

2.3 在PGD的應(yīng)用

植入前診斷(PGD)只能獲得非常有限的模版，而熒光PCR比溴乙錠染色要敏感1 000倍，因此，熒光PCR在植入前診斷中的應(yīng)用已經(jīng)有較多的探索。等位基因失擴(kuò)增(ADO)和污染是植入前診斷所面臨的兩個(gè)主要問(wèn)題，因此PGD需要檢測(cè)致病基因和連鎖分析進(jìn)行聯(lián)合判斷。但是限于取材，PGD只能提供一次PCR的模版。熒光PCR由于高靈敏度和分辨率，適合對(duì)少量模版進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，在一個(gè)體系中同時(shí)完成對(duì)疾病基因的檢測(cè)和連鎖分析。Joycec采用熒光多重PCR對(duì)6種遺傳?。簭?qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良(DM)、囊性纖維(CF)、脆性X綜合征、神經(jīng)纖維化2型和顱面成骨不全癥進(jìn)行了植入前診斷。在進(jìn)行PCR的過(guò)程中都同時(shí)擴(kuò)增了一個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，以確定被擴(kuò)增細(xì)胞的來(lái)源以及排除污染[9]。對(duì)于顯性遺傳病，多態(tài)位點(diǎn)還能夠減少ADO可能帶來(lái)的誤診。在他們進(jìn)行的研究中，對(duì)14次妊娠進(jìn)行的植入前診斷都得到明確結(jié)論，其中13例進(jìn)行了胚胎移植，另有1例沒(méi)有檢測(cè)到正常胚胎。

總之，PCR技術(shù)在定量與定位領(lǐng)域中的應(yīng)用已經(jīng)逐漸由實(shí)驗(yàn)室中的探索發(fā)展成為理解復(fù)雜的生物本質(zhì)的一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)。毫無(wú)疑問(wèn)，在不久的將來(lái)，熒光定量PCR技術(shù)將以其精確的定量，簡(jiǎn)單迅速的操作，合理的成本，在分子生物學(xué)、實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)，特別是臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中得到更加廣泛的應(yīng)用。

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（收稿日期：2009-03-15）