分子雜交技術(shù)的應(yīng)用簡(jiǎn)述

黃鳳珍

核酸分子雜交技術(shù)是利用DNA變性與復(fù)性的原理，在某種理化因素作用下DNA雙鏈分子解鏈變性后，在DNA復(fù)性重新形成雙螺旋結(jié)構(gòu)時(shí)，把不同的DNA單鏈分子或者DNA與RNA的混合物放在同一溶液中，只要在DNA或RNA單鏈分子之間存在一定的堿基互補(bǔ)配對(duì)關(guān)系，就可以在DNA之間或DNA與RNA之間形成雜化的雙鏈。蛋白質(zhì)分子雜交是一種借助特異性抗體鑒定抗原的有效方法。分子雜交技術(shù)有很多種，下面重點(diǎn)介紹三種常用的分子雜交技術(shù)的基本流程和應(yīng)用。

1Southern雜交——DNA和DNA分子之間的雜交

1.1基本流程

第一步，從組織或細(xì)胞中提取出DNA，經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)南拗泼盖泻筮M(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，將不同大小的片段分開(kāi)；

第二步，將凝膠上的DNA片段轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上；

第三步，用標(biāo)記了放射性同位素(或生物素)的目的基因的DNA片段作為探針與硝酸纖維素膜上的DNA進(jìn)行雜交；

第四步，將X光底片壓在硝酸纖維素膜上，在暗處使底片感光；

第五步，將X光底片沖洗，如果在底片上出現(xiàn)黑色條帶，則表明待測(cè)樣品中含有目的基因。

1.2具體應(yīng)用

Southern雜交主要用來(lái)研究DNA分子中某一基因位置、某一專一序列在待檢樣品中存在與否及兩種核酸分子之間的相似性。具體來(lái)說(shuō)，此項(xiàng)分子雜交的應(yīng)用有以下幾點(diǎn)。

1.2.1用于對(duì)基因組中特定基因的定位及檢測(cè)

如基因工程中用于檢測(cè)目的基因是否整合到受體生物的染色體DNA中。這是目的基因能否在真核生物中穩(wěn)定遺傳的關(guān)鍵。

1.2.2用于從基因文庫(kù)中找到所需要的基因

將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存，構(gòu)建了該種生物的基因文庫(kù)，但如何從基因文庫(kù)中找到所需要的基因呢?具體做法如下。

第一步，通過(guò)PCR方法將目的基因已知的部分核苷酸序列擴(kuò)增出來(lái)，制成探針。

第二步，將基因文庫(kù)中的所有菌落轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，然后通過(guò)處理，溶解消化掉細(xì)菌中的蛋白質(zhì)，并使DNA固定在膜上。

第三步，按Southem雜交的方法進(jìn)行雜交。

第四步，在X光底片上出現(xiàn)黑斑的菌落含有所需要的目的基因(若選用別的標(biāo)記方法，有陽(yáng)性信號(hào)的菌落則含有所需要的目的基因)。

第五步，從該菌落中再提取目的基因。

1.2.3用于基因診斷遺傳病、癌癥等

舉兩個(gè)常見(jiàn)的病例：

鐮刀型細(xì)胞貧血癥是β－珠蛋白基因第六個(gè)密碼子發(fā)生單個(gè)堿基突變(A-T)，這一突變使該基因內(nèi)部一個(gè)MstⅡ限制酶位點(diǎn)丟失。因此，將正常人和帶有突變基因個(gè)體的基因組DNA用MstⅡ切割后，與β—珠蛋白基因探針雜交，即可將正常人、突變基因攜帶者及鐮刀型細(xì)胞癥患者區(qū)別開(kāi)來(lái)，如圖1所示。

苯丙酮尿癥(PKU)是新生兒中發(fā)病率較高的一種遺傳病，如果用限制性內(nèi)切酶EcoRV酶解苯丙酮尿癥患兒及其父母的DNA，再與苯丙氨酸羥化酶基因探針雜交，分析雜交片段后就會(huì)發(fā)現(xiàn)其父母都具有30 kb／25 kb酶特異片段，患兒則具有30 kb／30 kb片段。這說(shuō)明患兒的2條30 kb片段都與致病基因連鎖，分別從父母親處遺傳而來(lái)，而父母親另一條染色體的25 kb不與致病基因連鎖。在此基礎(chǔ)上，分析另一未知胎兒，如果雜交圖譜顯示30 kb／25 kb特異片段，就可診斷胎兒為雜合子，如果雜交圖譜顯示為30 kb／30 kb片段，即為患兒。

2Northern雜交——DNA和RNA分子之間的雜交

2.1基本流程

與Southern雜交相同，只是第一步從組織或細(xì)胞中提取的是mRNA而不是DNA，另外由于RNA分子較小，在轉(zhuǎn)移前無(wú)需進(jìn)行限制酶切割。

2.2具體應(yīng)用

目前主要用于檢測(cè)某一組織或細(xì)胞中已知的特異性mRNA的表達(dá)水平或比較不同組織或細(xì)胞中同一基因的表達(dá)情況，如在基因工程中是檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA的方法。

如果RNA分子在大小和含量上與正常情況不同，可以考慮是否有調(diào)控區(qū)的突變或剪接部分的突變。

3Western雜交——蛋白質(zhì)分子(抗原－抗體)之間的雜交。

3.1基本流程

以檢測(cè)目的基因在受體細(xì)胞中是否表達(dá)出相應(yīng)的蛋白質(zhì)為例，其具體做法是：

第一步，將目的基因在大腸桿菌中表達(dá)出蛋白質(zhì)；

第二步，將表達(dá)出的蛋白質(zhì)注射給動(dòng)物進(jìn)行免疫，產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，并提取出抗體(一抗)；

第三步，從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)，進(jìn)行凝膠電泳；

第四步，將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上；

第五步，將抗體(一抗)與硝酸纖維素膜上的蛋白質(zhì)雜交，這時(shí)抗體(一抗)與目的基因表達(dá)的蛋白(抗原)會(huì)特異結(jié)合。由于這種抗原－抗體的結(jié)合顯示不出條帶，所以加入一種稱為二抗的抗體，它可以與一抗結(jié)合，二抗抗體上帶有特殊的標(biāo)記。如果目的基因表達(dá)出了蛋白質(zhì)，則結(jié)果為陽(yáng)性。

Western雜交與上述兩種雜交技術(shù)不同的是，蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移只有靠電轉(zhuǎn)移方可完成。另外蛋白質(zhì)的檢測(cè)是以抗體而不是以核酸作探針。上述三種雜交技術(shù)都需要將存在于凝膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移(印跡)于固定化介質(zhì)上并加以分析，稱為印跡技術(shù)?；玖鞒炭捎脠D2歸納。

3.2具體應(yīng)用

可用于檢測(cè)樣品中特異蛋白質(zhì)是否存在、細(xì)胞中特異蛋白質(zhì)的半定量分析以及蛋白質(zhì)分子的相互作用研究等。如檢測(cè)目的基因在受體細(xì)胞中有沒(méi)有翻譯出相應(yīng)的蛋白質(zhì)，檢測(cè)病人血液中是否有某種抗體從而檢測(cè)是否感染過(guò)某種抗原，單克隆抗體技術(shù)中用于篩選出能產(chǎn)生特定抗體的雜交瘤細(xì)胞等。