• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    納豆激酶生產(chǎn)菌的篩選及發(fā)酵納豆特性研究

    2015-10-26 05:49:06趙仲麟李淑英聶瑩李燕袁超唐選明
    生物技術(shù)通報 2015年3期
    關(guān)鍵詞:拉絲納豆酪蛋白

    趙仲麟李淑英聶瑩李燕袁超唐選明

    (1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院,鄭州 450002;2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,北京 100193;3.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院,鄭州 450002)

    納豆激酶生產(chǎn)菌的篩選及發(fā)酵納豆特性研究

    趙仲麟1李淑英2聶瑩2李燕3袁超1唐選明2

    (1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院,鄭州 450002;2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,北京 100193;3.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院,鄭州 450002)

    為開發(fā)具有特定生理活性的新型納豆保健品,從發(fā)酵豆制品中分離篩選得到一株納豆激酶高產(chǎn)菌株。利用該菌株以及市售的3種納豆中的納豆菌進行納豆發(fā)酵,比較了4株納豆菌發(fā)酵納豆的特性,并對納豆激酶活性進行分析。結(jié)果表明5號菌株發(fā)酵生產(chǎn)納豆周期短,顏色金黃,具有醬香味,拉絲長度最佳。同時,對產(chǎn)納豆激酶的最佳發(fā)酵時間進行研究,結(jié)果表明發(fā)酵至17 h納豆激酶活性達到最大值。

    納豆激酶;篩選;酶活;特性

    納豆作為一種日本傳統(tǒng)食物已有上千年的歷史,是大豆經(jīng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵而來。納豆中含有納豆激酶,是具有強力的纖維蛋白溶解特性一種酶類[1]。利用其特性可以開發(fā)相關(guān)的抗血栓癥藥物。血栓則是由血小板和纖維蛋白聚集形成的,有效的血栓溶解劑能切開血栓上纖維蛋白凝塊,如纖溶酶。納豆激酶屬于枯草桿菌絲氨酸蛋白酶,其溶血栓活性是纖溶酶的4倍[2]。研究顯示納豆激酶可在體外將血栓水解,間接地將血纖維蛋白溶酶原轉(zhuǎn)化為血纖維蛋白溶酶,使纖維蛋白凝塊水解,通過抑制血小板的凝聚和血栓的形成從而改善血流[3]。Xu等[4]使用不同劑量的納豆激酶處理血栓小鼠,發(fā)現(xiàn)納豆激酶對血栓還具有體內(nèi)活性。

    納豆激酶不僅可以直接溶解交聯(lián)狀的血栓,還可以催化血纖維蛋白溶酶原轉(zhuǎn)化為有活性的血纖維蛋白溶酶,增加體內(nèi)血栓溶解因子,諸如t-PA的合成,失活纖維蛋白溶酶抑制劑(PAI-1)等,在體內(nèi)具有增強的血栓溶解活性[5];與臨床藥物相比,具有纖溶活性高、無毒副作用、半衰期長、生產(chǎn)成本低廉等優(yōu)點[6,7]。Fadl等[8]發(fā)現(xiàn)納豆激酶對緩解阿爾茨海默病也有一定幫助。因此,納豆是一種潛在的、可以開發(fā)為一種預(yù)防和治療心腦血管疾病的功能食品[9]。本研究對納豆激酶生產(chǎn)菌進行了分離篩選,并將得到的高產(chǎn)菌株到與其他3種市售納豆菌進行納豆發(fā)酵,對產(chǎn)品的感官和納豆激酶酶活進行比較,以期為納豆激酶生產(chǎn)菌株的生產(chǎn)應(yīng)用及潛在的市場應(yīng)用價值進行評估。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 樣品 市售及民間豆醬、豆豉等各種發(fā)酵豆制品,均購買于超市。

    1.1.2 試劑 纖維蛋白原(牛血,批號:140626-201009)、尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品(1280 U/支)和凝血酶(560 U/支)均購于中國藥品生物制品檢定所;LB Broth Ultrapure(USB),胰蛋白胨(OXOID),酪蛋白(Sigma),其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

    1.1.3 培養(yǎng)基 篩選培養(yǎng)基為酪蛋白平板培養(yǎng)基,具體配方:酪蛋白 1%、酵母提取物 0.5%、NaCl 0.9%、瓊脂2%,pH7.2-7.4,121℃滅菌20 min,現(xiàn)配現(xiàn)用。種子和液體發(fā)酵培養(yǎng)基:LB培養(yǎng)基,酪蛋白 1%、酵母提取物 0.5%、NaCl 1%,pH7.0,121℃滅菌20 min。

    1.2 方法

    1.2.1 納豆激酶生產(chǎn)菌株篩選 取 5 g 發(fā)酵豆制品,放入裝有 20 mL 無菌生理鹽水和10余顆玻璃珠的三角瓶中,每隔10 min 振蕩1 次,室溫下浸提1 h,3 000 r/min離心5 min,制得菌懸液;85℃熱處理30 min,生理鹽水倍比稀釋后,取 100 μL 涂布酪蛋白平板,30℃培養(yǎng)18 h。復(fù)篩時,觀察酪蛋白平板上的單菌落,挑選溶解圈大的菌株用無菌牙簽點酪蛋白平板,30℃培養(yǎng)12 h,選取溶解圈較大的菌株,反復(fù)篩選5次后,接種LB單菌落平板,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2 納豆制備及粗酶液的提取 將篩選菌株接種到3 mL LB液體培養(yǎng)基,37℃過夜培養(yǎng)活化菌株;2%的接菌量轉(zhuǎn)接到50 mL LB液體培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)4 h,4 000 r/min離心10 min收集菌株,生理鹽水洗3次,稱取菌株濕重,加入生理鹽水,配置成相同菌液濃度的菌懸液(菌落數(shù)約為107/mL)備用。大豆原料洗凈,浸泡后分裝成200 g每瓶,蒸煮,放涼(約50℃左右),將1 mL菌懸液加入滅菌的黃豆中,發(fā)酵至表面產(chǎn)生白膜后停止發(fā)酵,4℃后熟12 h得納豆成品。

    取從各種豆制品中分離純化得到的高活力菌株,按照以上工藝生產(chǎn)納豆,以拉絲長度評價納豆品質(zhì)。拉絲長度測定:用筷子挑起,20 cm為一單位,從中間部位再拉20 cm,重復(fù)進行,直至拉斷。

    取適量發(fā)酵好的納豆放入燒杯,加入5倍體積的生理鹽水,于4℃下以磁力攪拌器攪拌2 h,以6層紗布過濾除豆渣,取納豆液,12 000×g、4℃離心5 min,所得上清液,即為納豆激酶粗提液。

    1.2.3 納豆激酶酶活分析 纖維蛋白平板法測納豆激酶活力,為改進的Astrup法[10],具體如下:0.1 g瓊脂糖加到10 mL 10 mmol/L PBS(pH7.2),微波爐加熱溶解,50℃恒溫水浴10 min;0.01 g纖維蛋白原加到10 mL 10 mmol/L PBS(pH7.2),玻璃棒攪勻,50℃恒溫水浴10 min;將10 μL凝血酶(0.1 IU/μL)加到瓊脂糖溶液中,混勻;再將纖維蛋白原溶液加入瓊脂糖溶液中,迅速混勻并倒于9×9 cm平皿中,室溫放置90 min,使其充分凝固。5 mm打孔器打孔,上樣,室溫放置10 min,于37℃恒溫18 h,游標(biāo)卡尺測量溶解圈的兩個垂直直徑,計算溶解圈的面積,根據(jù)尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線計算酶的活力單位。尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作參考馬明等[11]的方法。

    1.2.4 最適發(fā)酵時間分析 將篩選菌株活化后,按方法1.2.2和1.2.3進行納豆的發(fā)酵,于13 h 起每隔1 h取5 g納豆,連續(xù)取5 h,分別提取納豆激酶粗酶液進行酶活分析。

    2 結(jié)果

    2.1 納豆菌的篩選

    以從日本納豆中篩選的菌株為陽性對照,從多家超市購買納豆、豆醬、豆豉及民間自釀豆醬等發(fā)酵豆制品中篩選納豆激酶產(chǎn)生菌。通過酪蛋白平板法檢測菌落蛋白酶水解活性,最終獲得具有較明顯溶解圈的菌株 8株,其中5號菌落水解圈最大。通過納豆激酶活性測定,結(jié)果顯示5號菌落具有最好的酶活性(圖1-A),納豆激酶活性分析顯示5號菌產(chǎn)的激酶活性最高(圖1-B)。

    圖1 菌落蛋白酶水解活性試驗

    2.2 納豆的感官評價

    利用5號菌株以及從市售的3種納豆(S1,S2,S3)中分離到的納豆菌進行納豆發(fā)酵,對大豆發(fā)酵后制得納豆進行感官評價。4種發(fā)酵納豆產(chǎn)品均為亮黃色,具有納豆特有的醬香氣味,納豆絲里含納豆激酶,拉絲長度測定結(jié)果,如圖2。5號菌株發(fā)酵所得納豆拉絲長度最好,為75 cm;其次為S2納豆菌發(fā)酵所得納豆,拉絲長度60 cm;S1納豆和S3納豆相對較短,拉絲長度分別為54 cm和45 cm。

    圖2 納豆產(chǎn)品的拉絲長度比較

    2.3 納豆激酶活性分析

    從5號菌株和其他市售的3種納豆分離出的納豆菌發(fā)酵得到的納豆中提取粗酶液,進行活性分析,結(jié)果如表1所示。S2納豆菌和S1納豆菌所產(chǎn)的納豆激酶活性最高,約為131 FU/g,5號納豆的納豆激酶活性次之,為121.538 FU/g,S3納豆中納豆激酶活性為100 FU/g。雖然5號菌株發(fā)酵納豆的納豆激酶活性居中,但是該菌株實現(xiàn)了較快的發(fā)酵速度,發(fā)酵形成白膜的時間較其他菌株早大約2 h,且產(chǎn)生白膜的厚度和黏度明顯強于其他菌株,這也可能是其拉絲長度強于其他菌株的原因。

    表1 納豆激酶酶活分析

    2.4 最適發(fā)酵時間分析

    為研究5號菌株發(fā)酵納豆的特性,找到最佳發(fā)酵時間,將5號菌株活化后進行納豆發(fā)酵,從13 h開始每隔1 h取樣,提取粗酶液,纖維蛋白法測定粗酶液活性,并繪制5號菌株納豆發(fā)酵過程中納豆激酶活性曲線(圖3)。結(jié)果表明,隨著發(fā)酵時間的延長,5號菌株發(fā)酵納豆產(chǎn)生的納豆激酶呈緩慢遞增的趨勢,17-18 h趨于平緩,17 h時的納豆激酶活性最高,為92.278 FU/g。

    圖3 5號菌株納豆激酶活性曲線

    3 討論

    本試驗對分離篩選的納豆激酶生產(chǎn)菌與其他3種市售納豆菌進行了納豆發(fā)酵,對產(chǎn)品和納豆激酶酶活性進行了比較。5號菌發(fā)酵得到的產(chǎn)品口感佳、氣味好,雖然酶活相對居中,但具有最高的拉絲長度。此外,5號菌株發(fā)酵納豆產(chǎn)生的納豆激酶呈緩慢遞增的趨勢,17 h的納豆激酶活性最高,相比其他3株納豆菌發(fā)酵時間略短。菌株的發(fā)酵條件對產(chǎn)品中納豆激酶含量的影響較大,可以通過酶活優(yōu)化培養(yǎng)基組成和發(fā)酵工藝提高芽孢桿菌的納豆激酶產(chǎn)量[12],通過采用單因素和正交試驗對篩選菌株的納豆激酶的液體發(fā)酵條件進行研究,也可通過分子生物學(xué)的手段對納豆激酶基因進行改造[13],以期提高納豆激酶產(chǎn)量,為該酶的進一步擴大培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。

    目前已商業(yè)化應(yīng)用的納豆激酶熱穩(wěn)定性較差,溫度到達60℃時,納豆激酶瞬間失活,在制備膠囊和長期運輸?shù)倪^程中會喪失大部分活力,影響其實際使用效果。通過增加酶量,且在低溫儲運來緩解納豆激酶的活性損失,不利用工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)及推廣。另外,納豆激酶在酸性環(huán)境下也容易失活,在胃液環(huán)境中將完全失去活性。因此,未來的研究主要集中在納豆激酶基因的篩選及產(chǎn)品包被膠囊化等方面[14,15],以期得到性能優(yōu)良、可商品化的納豆激酶。我們后期的研究主要是克隆該納豆激酶的基因,并對其進行突變改造,以期提高其酶活性及熱穩(wěn)定性。

    4 結(jié)論

    本研究篩選到了一株納豆激酶生產(chǎn)菌,利用該菌株以及市售的3種納豆中的納豆菌進行納豆發(fā)酵試驗,篩選到的5號菌株發(fā)酵生產(chǎn)納豆的周期較短,得到的納豆產(chǎn)品顏色金黃,具有醬香味,拉絲長度極佳。表明發(fā)酵至17 h納豆激酶活性達到最大值,該菌株可作為潛在的納豆生產(chǎn)菌株。

    [1] Tai MW, Sweet BV. Nattokinase for prevention of thrombosis[J]. Am J Health Syst Pharm, 2006, 63(12):1121-1123.

    [2] Fujita M, Ohnishi K, Takaoka S. Antihypertensive effects of continuous oral administration of nattokinase and its fragments in spontaneously hypertensive rats[J]. Biol Pharm Bull, 2011, 34(11)1696-1701.

    [3] Jang JY, Kim TS, Cai J, et al. Nattokinase improves blood flow by inhibiting platelet aggregation and thrombus formation[J]. Lab Anim Res, 2013, 29(4):221-225.

    [4] Xu J, Du M, Yang X, et al. Thrombolytic effects in vivo of nattokinase in a carrageenan-induced rat model of thrombosis[J]. Acta Haematol, 2014, 132(2):247-253.

    [5] Urano T, Ihara H, Umemura K, et al. The profibrinolytic enzyme subtilisin NAT purified from Bacillus subtilis cleaves and inactivates plasminogen activator inhibitor type 1[J]. J Biol Chem, 2001,276:24690-24696.

    [6] Jovin IS, Muller BG. Inter-relationships between the fibrinolytic system and lipoproteins in the pathogenesis of coronary atherosclerosis[J]. Atherosclerosis, 2004, 174:225-233.

    [7] Ero MP, Ng CM, Mihailovski T, et al. A pilot study on the serum pharmacokinetics of nattokinase in humans following a single, oral,daily dose[J]. Altern Ther Health Med, 2013, 19(3):16-19.

    [8] Fadl NN, Ahmed HH, et al. Sayed AH. Serrapeptase and nattokinase intervention for relieving Alzheimer's disease pathophysiology in rat model[J]. Hum Exp Toxicol, 2013, 32(7):721-735.

    [9] 李淑英, 趙仲麟, 聶瑩, 等. 納豆激酶研究進展[J]. 中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報, 2013, 15(4):139-143.

    [10] Astrup T, Mullertz S. The fibrin plate method for estimating fibrinolytic activity[J]. Arch Biochem Biophys, 1952, 40(2):346-351.

    [11] 馬明, 杜金華, 于玲, 等. 高納豆激酶酶活枯草芽孢桿菌的篩選及菌種鑒定[J]. 中國食物與營養(yǎng), 2006(8):29-32.

    [12] 李淑英, 聶瑩, 杜歡, 等. 納豆激酶生產(chǎn)菌BSNK-5鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 生物技術(shù)通報, 2013(2):184-189.

    [13] Nguyen TT, Quyen TD, Le HT. Cloning and enhancing production of a detergent- and organic-solvent-resistant nattokinase from Bacillus subtilis VTCC-DVN-12-01 by using an eight-proteasegene-deficient Bacillus subtilis WB800[J]. Microb Cell Fact,2013, 12:79.

    [14] Wei XT, Luo MF, et al. Strain Screening, fermentation, separation,and encapsulation for production of nattokinase functional food[J]. Appl Biochem Biotechnol, 2012, 168:1753-1764.

    [15] Dong XY, Kong FP, Yuan GY, et al. Optimisation of preparation conditions and properties of phytosterol liposome-encapsulating nattokinase[J]. Nat Prod Res, 2012, 26(6):548-556.

    (責(zé)任編輯 李楠)

    Screening of Nattokinase Producing Strain and Characterazation of Nattokinase

    Zhao Zhonglin1Li Shuying2Nie Ying2Li Yan3Yuan Chao1Tang Xuanming2
    (1. College of Sciences,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002;2. Institute of Agro-products Processing Science and Technology,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100193;3. School of Food and Biological Engineering,Zhengzhou University of Light Industry,Zhengzhou 450002)

    To develop new kinds of natto health care products with specific physiological activity, a nattokinase high-yield strain was isolated and used for natto production. The characteristics and nattokinase activities of the isolated strain were compared with other 3 kinds of natto strains. Results showed that the natto products of munber 5 strain have golden color and soy sauce flavor, and have the best length of natto wire drawing. The result of fermentation time showed that nattokinase content reached the maximum value at 17 h.

    nattokinase;screen;enzyme activity;characteristic

    10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.023

    2014-09-05

    中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技經(jīng)費項目(201211),公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項經(jīng)費項目(201303080)

    趙仲麟,男,博士,副教授,研究方向:化學(xué)生物學(xué)、環(huán)境微生物;E-mail:rayzzl@163.com

    李淑英,女,博士,助研,研究方向:微生物生化與分子生物學(xué);E-mail:lishuying@caas. cn

    猜你喜歡
    拉絲納豆酪蛋白
    拉絲磁盤
    銅拉絲液起泡問題解決及日常維護
    蛋氨酸對奶牛乳腺酪蛋白合成及其上皮細胞自噬的影響
    中國飼料(2022年5期)2022-04-26 13:42:32
    一種導(dǎo)熱式塑料拉絲冷卻裝置
    氣體密度調(diào)控激光拉絲太赫茲輻射機理
    納豆改變命運 養(yǎng)生成就人生
    納豆改變命運養(yǎng)生成就人生
    納豆改變命運 養(yǎng)生成就人生
    納豆改變命運 養(yǎng)生成就人生
    酪蛋白磷酸肽-鈣絡(luò)合物對酸乳貯藏特性的影響
    中國釀造(2016年12期)2016-03-01 03:08:23
    国产真实乱freesex| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 美女午夜性视频免费| 全区人妻精品视频| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 亚洲第一电影网av| cao死你这个sao货| 国产三级黄色录像| 国产免费av片在线观看野外av| 此物有八面人人有两片| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 久久久久九九精品影院| 日韩欧美免费精品| 亚洲国产精品成人综合色| 露出奶头的视频| 视频区欧美日本亚洲| 天堂动漫精品| 亚洲av成人av| 中文字幕熟女人妻在线| 宅男免费午夜| 特级一级黄色大片| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 欧美久久黑人一区二区| 精品熟女少妇八av免费久了| 毛片女人毛片| 最近在线观看免费完整版| 欧美乱妇无乱码| 久久午夜亚洲精品久久| 精品久久久久久久末码| 人成视频在线观看免费观看| 黄频高清免费视频| 日韩欧美免费精品| 国产高清视频在线观看网站| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 韩国av一区二区三区四区| 欧美一级a爱片免费观看看 | 黄色视频不卡| 九色成人免费人妻av| 少妇熟女aⅴ在线视频| 午夜成年电影在线免费观看| 美女扒开内裤让男人捅视频| 成人国语在线视频| www日本在线高清视频| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 中文亚洲av片在线观看爽| 国产激情欧美一区二区| 久久热在线av| 日韩欧美国产在线观看| 欧美中文综合在线视频| 女人被狂操c到高潮| 91国产中文字幕| 日韩大码丰满熟妇| 亚洲五月天丁香| 九色成人免费人妻av| 岛国视频午夜一区免费看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 亚洲国产欧美网| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 欧美中文综合在线视频| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 精品无人区乱码1区二区| 亚洲精华国产精华精| 舔av片在线| 久久久久久国产a免费观看| 麻豆国产97在线/欧美 | 国产人伦9x9x在线观看| 久9热在线精品视频| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 一区二区三区高清视频在线| 日日爽夜夜爽网站| www.熟女人妻精品国产| 精品久久久久久久末码| 色噜噜av男人的天堂激情| 身体一侧抽搐| 亚洲国产精品合色在线| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 亚洲av电影不卡..在线观看| 欧美丝袜亚洲另类 | 在线观看www视频免费| 老汉色∧v一级毛片| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 我的老师免费观看完整版| 91字幕亚洲| 国产99白浆流出| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 日本成人三级电影网站| 欧美高清成人免费视频www| 99精品在免费线老司机午夜| 久久久久性生活片| 制服诱惑二区| 香蕉丝袜av| 精品国产乱码久久久久久男人| 欧美三级亚洲精品| 看免费av毛片| 久久久久久久精品吃奶| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 啦啦啦免费观看视频1| 嫩草影视91久久| 国产1区2区3区精品| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 级片在线观看| 精品日产1卡2卡| 国内精品久久久久久久电影| 免费在线观看成人毛片| 国产亚洲欧美98| 在线观看免费午夜福利视频| 麻豆成人午夜福利视频| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| bbb黄色大片| 亚洲人成77777在线视频| 久久久久久大精品| 亚洲性夜色夜夜综合| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 岛国在线免费视频观看| 亚洲国产精品sss在线观看| 12—13女人毛片做爰片一| 亚洲一区中文字幕在线| 国产日本99.免费观看| 中亚洲国语对白在线视频| 色播亚洲综合网| 精品日产1卡2卡| 亚洲五月婷婷丁香| 久久国产精品影院| 成人18禁在线播放| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 亚洲黑人精品在线| 搡老妇女老女人老熟妇| 久99久视频精品免费| 亚洲性夜色夜夜综合| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 可以在线观看毛片的网站| 黄色a级毛片大全视频| 亚洲午夜理论影院| 久久精品国产综合久久久| 不卡av一区二区三区| 国产精品亚洲一级av第二区| 日韩欧美国产一区二区入口| 亚洲 国产 在线| 久久久久亚洲av毛片大全| 五月伊人婷婷丁香| 亚洲,欧美精品.| 久久久精品欧美日韩精品| 免费人成视频x8x8入口观看| 午夜激情福利司机影院| 夜夜夜夜夜久久久久| 热99re8久久精品国产| 狂野欧美激情性xxxx| 女警被强在线播放| 国产欧美日韩一区二区精品| 黄色片一级片一级黄色片| 在线看三级毛片| 狂野欧美激情性xxxx| 国产成人啪精品午夜网站| 啦啦啦韩国在线观看视频| 天堂影院成人在线观看| 亚洲一区高清亚洲精品| 老司机午夜十八禁免费视频| 免费搜索国产男女视频| 免费在线观看黄色视频的| 美女黄网站色视频| 男人舔女人下体高潮全视频| av国产免费在线观看| 一进一出抽搐gif免费好疼| 亚洲精品中文字幕在线视频| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 国产精品免费视频内射| 无遮挡黄片免费观看| 搡老岳熟女国产| 深夜精品福利| 岛国在线免费视频观看| 午夜精品在线福利| www.精华液| 国产片内射在线| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 日本一区二区免费在线视频| 日韩欧美在线二视频| 日韩欧美在线乱码| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 一本精品99久久精品77| 国产探花在线观看一区二区| 午夜日韩欧美国产| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 免费高清视频大片| 精品国产乱码久久久久久男人| 亚洲七黄色美女视频| 日韩高清综合在线| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 久久久久久久久免费视频了| 曰老女人黄片| 日本免费一区二区三区高清不卡| 亚洲18禁久久av| 日韩欧美免费精品| 国产精品久久视频播放| 国产日本99.免费观看| 女人被狂操c到高潮| 伦理电影免费视频| 精品高清国产在线一区| 日本成人三级电影网站| 成人三级黄色视频| 免费在线观看完整版高清| 久久久久久大精品| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 精品欧美国产一区二区三| 国产日本99.免费观看| 国产av一区在线观看免费| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| xxx96com| 国内精品久久久久精免费| 99热这里只有是精品50| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲成av人片在线播放无| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 一边摸一边做爽爽视频免费| 日韩欧美 国产精品| ponron亚洲| 嫩草影视91久久| 两个人免费观看高清视频| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 欧美+亚洲+日韩+国产| 黄色女人牲交| 午夜福利免费观看在线| 日韩大码丰满熟妇| 久99久视频精品免费| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 精品久久久久久久久久免费视频| 窝窝影院91人妻| 在线观看www视频免费| 一区福利在线观看| 黄片小视频在线播放| 亚洲无线在线观看| 桃色一区二区三区在线观看| 久久久久免费精品人妻一区二区| 国产免费男女视频| 日本黄大片高清| 国产精品久久久av美女十八| 亚洲精品粉嫩美女一区| cao死你这个sao货| 精品熟女少妇八av免费久了| 成年女人毛片免费观看观看9| 99久久综合精品五月天人人| 欧美国产日韩亚洲一区| 亚洲av片天天在线观看| 在线观看66精品国产| 欧美在线黄色| 久久久国产精品麻豆| 国模一区二区三区四区视频 | 午夜免费观看网址| 极品教师在线免费播放| 制服诱惑二区| 成人三级做爰电影| 在线观看舔阴道视频| 成人特级黄色片久久久久久久| 午夜福利高清视频| 国产成人系列免费观看| 亚洲精品美女久久av网站| 51午夜福利影视在线观看| 国产亚洲av嫩草精品影院| 久久久国产成人免费| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 老司机深夜福利视频在线观看| av天堂在线播放| 欧美一区二区国产精品久久精品 | 99在线视频只有这里精品首页| 国产单亲对白刺激| 亚洲午夜理论影院| 麻豆成人av在线观看| 亚洲成人精品中文字幕电影| 91成年电影在线观看| www.www免费av| 亚洲精品国产一区二区精华液| 怎么达到女性高潮| 久久久久久免费高清国产稀缺| 精华霜和精华液先用哪个| 长腿黑丝高跟| 日日干狠狠操夜夜爽| 可以在线观看的亚洲视频| 狂野欧美激情性xxxx| 黄色毛片三级朝国网站| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 欧美av亚洲av综合av国产av| 一二三四社区在线视频社区8| 成人av在线播放网站| 精品一区二区三区av网在线观看| 午夜福利高清视频| 天天添夜夜摸| 三级毛片av免费| 一区二区三区国产精品乱码| 亚洲一区二区三区色噜噜| 国产黄a三级三级三级人| 国产成人aa在线观看| 窝窝影院91人妻| 日本五十路高清| 亚洲性夜色夜夜综合| 欧美一级毛片孕妇| 色老头精品视频在线观看| 国产一区二区在线观看日韩 | 成人手机av| svipshipincom国产片| 国产精品久久久久久久电影 | 色av中文字幕| 欧美精品啪啪一区二区三区| 99国产极品粉嫩在线观看| 91成年电影在线观看| 很黄的视频免费| 一本综合久久免费| 国产亚洲精品第一综合不卡| 99在线人妻在线中文字幕| 久久久久九九精品影院| 欧美另类亚洲清纯唯美| 精品福利观看| 亚洲成人中文字幕在线播放| 免费搜索国产男女视频| 黄色丝袜av网址大全| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 欧美在线黄色| 性色av乱码一区二区三区2| 久久久国产成人精品二区| 一本综合久久免费| 国产精品,欧美在线| 最近在线观看免费完整版| 中文字幕av在线有码专区| 色噜噜av男人的天堂激情| 男插女下体视频免费在线播放| 国产av麻豆久久久久久久| 欧美又色又爽又黄视频| 欧美日韩乱码在线| 欧美中文综合在线视频| 亚洲专区字幕在线| 亚洲成人中文字幕在线播放| 日本a在线网址| 国产v大片淫在线免费观看| 无限看片的www在线观看| 精华霜和精华液先用哪个| 亚洲成av人片免费观看| 精品国产乱子伦一区二区三区| 亚洲一区二区三区色噜噜| 日本精品一区二区三区蜜桃| www.www免费av| 制服人妻中文乱码| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产精品,欧美在线| 午夜福利在线观看吧| 欧美国产日韩亚洲一区| 老司机在亚洲福利影院| 男女下面进入的视频免费午夜| 亚洲一码二码三码区别大吗| 少妇的丰满在线观看| 老熟妇乱子伦视频在线观看| av在线播放免费不卡| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 久久精品国产综合久久久| 亚洲精品在线观看二区| 日日干狠狠操夜夜爽| 精品久久久久久久久久久久久| 亚洲国产高清在线一区二区三| 国产一区二区在线av高清观看| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 国产午夜精品论理片| 午夜a级毛片| 男人的好看免费观看在线视频 | 五月玫瑰六月丁香| 亚洲欧美激情综合另类| 国产精品国产高清国产av| 久久精品国产清高在天天线| 夜夜爽天天搞| 成人一区二区视频在线观看| 美女免费视频网站| 久久精品成人免费网站| 亚洲成a人片在线一区二区| 国产精品亚洲美女久久久| 久久这里只有精品中国| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 欧美黄色淫秽网站| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 麻豆国产av国片精品| 黄色毛片三级朝国网站| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 69av精品久久久久久| 日本三级黄在线观看| 男女床上黄色一级片免费看| xxxwww97欧美| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 久久中文字幕一级| 一本精品99久久精品77| 日韩欧美国产一区二区入口| 久久精品成人免费网站| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 男男h啪啪无遮挡| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 精品熟女少妇八av免费久了| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 久久久久久大精品| 午夜久久久久精精品| 免费看a级黄色片| 两性夫妻黄色片| 日韩国内少妇激情av| 床上黄色一级片| 欧美一级毛片孕妇| 久久久久久人人人人人| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 舔av片在线| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 性色av乱码一区二区三区2| 又黄又爽又免费观看的视频| 日韩高清综合在线| 妹子高潮喷水视频| 欧美日韩福利视频一区二区| 久久久久亚洲av毛片大全| 在线看三级毛片| 人人妻人人澡欧美一区二区| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 两个人免费观看高清视频| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 亚洲精品色激情综合| 淫妇啪啪啪对白视频| 亚洲精品粉嫩美女一区| 欧美高清成人免费视频www| 舔av片在线| 日本熟妇午夜| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 国产一级毛片七仙女欲春2| 真人一进一出gif抽搐免费| 91字幕亚洲| 亚洲欧美激情综合另类| 亚洲自拍偷在线| 夜夜夜夜夜久久久久| 啦啦啦免费观看视频1| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产精品免费一区二区三区在线| 国产精品电影一区二区三区| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 国产免费男女视频| 久久精品成人免费网站| 一进一出抽搐gif免费好疼| 老司机午夜十八禁免费视频| 一a级毛片在线观看| 国产精品 欧美亚洲| 亚洲成人国产一区在线观看| 国产1区2区3区精品| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 成人永久免费在线观看视频| 最近最新免费中文字幕在线| 国产99白浆流出| 国产成人aa在线观看| 午夜福利18| 老司机福利观看| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 久久 成人 亚洲| 国产精品av久久久久免费| 天天一区二区日本电影三级| 中亚洲国语对白在线视频| 999久久久精品免费观看国产| 麻豆成人午夜福利视频| 日韩精品青青久久久久久| 国产97色在线日韩免费| 国产真人三级小视频在线观看| 黄色丝袜av网址大全| 老汉色av国产亚洲站长工具| 一级毛片高清免费大全| 亚洲九九香蕉| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 高清毛片免费观看视频网站| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 搞女人的毛片| 18美女黄网站色大片免费观看| 欧美三级亚洲精品| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 国产成人系列免费观看| 天堂影院成人在线观看| 国产午夜精品久久久久久| 国产伦在线观看视频一区| 老鸭窝网址在线观看| 久久精品91蜜桃| 亚洲人与动物交配视频| 亚洲国产精品sss在线观看| 欧美中文综合在线视频| 波多野结衣高清作品| 在线观看舔阴道视频| 岛国在线免费视频观看| 亚洲国产高清在线一区二区三| 99久久国产精品久久久| av国产免费在线观看| 午夜久久久久精精品| 久久久久久久午夜电影| 欧美性长视频在线观看| 桃红色精品国产亚洲av| 波多野结衣高清无吗| 校园春色视频在线观看| 久久中文看片网| 在线国产一区二区在线| 亚洲黑人精品在线| 欧美三级亚洲精品| 欧美色欧美亚洲另类二区| 国产精品av视频在线免费观看| 国产探花在线观看一区二区| 国产亚洲精品久久久久5区| 国产精品亚洲一级av第二区| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 啦啦啦免费观看视频1| 久久久久久久久免费视频了| 99国产综合亚洲精品| 在线a可以看的网站| 真人一进一出gif抽搐免费| 国产野战对白在线观看| 亚洲第一电影网av| 国产精品日韩av在线免费观看| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 国产av又大| 日韩欧美精品v在线| 在线播放国产精品三级| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 欧美性长视频在线观看| 欧美乱妇无乱码| 亚洲成人精品中文字幕电影| 久久久久精品国产欧美久久久| 视频区欧美日本亚洲| 精品福利观看| 日本一区二区免费在线视频| 色噜噜av男人的天堂激情| 黄色a级毛片大全视频| 精品国产乱码久久久久久男人| 国产精品免费视频内射| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 欧美在线黄色| 国产99久久九九免费精品| 最近最新中文字幕大全免费视频| 老汉色∧v一级毛片| 中出人妻视频一区二区| 精品乱码久久久久久99久播| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 男女视频在线观看网站免费 | 色av中文字幕| 99在线人妻在线中文字幕| 搞女人的毛片| 香蕉国产在线看| 美女大奶头视频| 午夜精品一区二区三区免费看| 精品免费久久久久久久清纯| 色哟哟哟哟哟哟| 性欧美人与动物交配| 国产精品久久久久久精品电影| 午夜日韩欧美国产| 又大又爽又粗| 日本五十路高清| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 国产精品av久久久久免费| 在线观看免费视频日本深夜| 夜夜夜夜夜久久久久| 岛国视频午夜一区免费看| 搞女人的毛片| 1024手机看黄色片| 成人三级黄色视频| 亚洲在线自拍视频| 午夜亚洲福利在线播放| 我的老师免费观看完整版| 成人亚洲精品av一区二区| АⅤ资源中文在线天堂| 中文资源天堂在线| 中亚洲国语对白在线视频| 婷婷精品国产亚洲av在线| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 在线观看美女被高潮喷水网站 | а√天堂www在线а√下载| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 亚洲成a人片在线一区二区| 他把我摸到了高潮在线观看| 午夜日韩欧美国产| 午夜免费激情av| 国产精品影院久久| 91在线观看av| 毛片女人毛片| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 精品一区二区三区av网在线观看| 亚洲av熟女| 午夜视频精品福利| 成人国语在线视频| 国产高清视频在线观看网站| 国内精品一区二区在线观看| 成人av在线播放网站| 草草在线视频免费看| 波多野结衣巨乳人妻| a在线观看视频网站| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 一级毛片精品| 一级片免费观看大全| 欧美又色又爽又黄视频| 亚洲人成网站高清观看| а√天堂www在线а√下载| 大型黄色视频在线免费观看| 国产av一区在线观看免费| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 俺也久久电影网| 美女免费视频网站| 一级毛片高清免费大全| 午夜免费激情av| 午夜福利欧美成人| 中文字幕高清在线视频| 禁无遮挡网站| av欧美777| 国产熟女xx| 男人的好看免费观看在线视频 | 中文字幕久久专区| 精品久久久久久久末码| 亚洲欧美日韩无卡精品| 窝窝影院91人妻| 十八禁人妻一区二区| 美女午夜性视频免费| 男男h啪啪无遮挡| 久久九九热精品免费| 国产又色又爽无遮挡免费看|