硫普羅寧與牛血清白蛋白相互作用的研究*

周能 周振

(玉林師范學(xué)院化學(xué)與生物系，天然產(chǎn)物研究所，玉林 537000)

硫普羅寧(Tiopronin)用于脂肪肝、早期肝硬化、急性、慢性、病毒性、酒精性及藥物性肝炎及重金屬中毒的治療。血清白蛋白是血漿中含量最豐富的載體蛋白，具有貯運(yùn)內(nèi)源代謝產(chǎn)物和外源藥物小分子等重要生理功能[1]。探討有機(jī)小分子與蛋白質(zhì)等生物大分子的相互作用模式與特征一直是目前生物化學(xué)和醫(yī)學(xué)界共同關(guān)注和感興趣的課題。筆者應(yīng)用熒光光譜法研究了在生理?xiàng)l件下(pH 7.4)不同溫度時(shí)，硫普羅寧與牛血清白蛋白(BSA)的相互作用，結(jié)果表明，硫普羅寧對(duì)BSA內(nèi)源熒光的猝滅機(jī)制屬于動(dòng)態(tài)猝滅與靜態(tài)猝滅相結(jié)合，計(jì)算了硫普羅寧與牛血清白蛋白之間的結(jié)合常數(shù)K，并根據(jù)熱力學(xué)參數(shù)確定了硫普羅寧與牛血清白蛋白之間的主要作用力類(lèi)型為疏水作用力。同步熒光結(jié)果表明，硫普羅寧對(duì)BSA的構(gòu)象沒(méi)有影響。此外，討論了共存金屬離子和甘草次酸對(duì)硫普羅寧與BSA結(jié)合作用的影響，為探討硫普羅寧在生物體內(nèi)與蛋白質(zhì)的作用機(jī)理和生物學(xué)效應(yīng)提供了理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

熒光分光光度計(jì)：F-2500型，日本Hitachi公司；

雙光束紅外分光光度計(jì)：WGH-30/6型，天津市港東科技發(fā)展有限公司;

石英比色皿：1 cm；

微量注射器：上海高鴿工貿(mào)有限公司；

旋渦混合器：XH-C型，金壇市醫(yī)療儀器廠；

精密天平：CP324S型， 德國(guó)賽多利斯股份公司；

數(shù)字酸度計(jì)：pHS-3D型，上海雷磁儀器廠；

牛血清白蛋白(BSA)：電泳純，以水配成2×10-5mol/L的溶液，于4℃保存?zhèn)溆?

硫普羅寧：生化試劑，純度為99%,河南省新誼藥業(yè)股份有限公司,以水配成8×10-3mol/L的溶液；

三羥甲基氨基甲烷(Tris)固體：AR,加濃鹽酸配制成pH 7.40的Tris-HCl緩沖溶液；

甘草次酸:生化試劑,純度不小于97%，以90%甲醇配成8.0×10-4mol/L的溶液；

實(shí)驗(yàn)用其它試劑均為分析純；

實(shí)驗(yàn)用水為雙重蒸餾水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

(1)硫普羅寧與BSA作用

在10 mL容量瓶中依次加入2 mL 0.50 mol/L NaCl溶液(用于維持離子強(qiáng)度)、2 mL pH 7.40的Tris-HCl緩沖溶液、2 mL BSA溶液，以水定容為10 mL,搖勻,在一定溫度下靜置30 min。取該溶液1 mL于石英比色皿中，以微量注射器依次加入一定體積的硫普羅寧等藥物，旋渦混勻，測(cè)定不同溫度下硫普羅寧對(duì)BSA的熒光猝滅光譜強(qiáng)度,同時(shí)測(cè)定同步熒光。設(shè)定熒光激發(fā)與發(fā)射的狹縫為2.5/2.5 nm，光電倍增(PMT)設(shè)為700 V，在280 nm的激發(fā)波長(zhǎng)下，掃描290～420 nm熒光光譜，結(jié)果為3次平行實(shí)驗(yàn)的平均值。

(2)甘草次酸、金屬離子對(duì)硫普羅寧與BSA作用的影響

取BSA溶液1 mL于石英比色皿中，以微量注射器分別加入定量Mg2+、Co2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+和甘草次酸(GA)溶液(加入體積小于3 μL),再以微量注射器依次加入一定體積(0、2.5、5、10、15、20、25、30 μL)的硫普羅寧等藥物，旋渦混勻，測(cè)定硫普羅寧對(duì)BSA的熒光猝滅光譜強(qiáng)度。

2 結(jié)果與討論

2.1 硫普羅寧對(duì)BSA的熒光猝滅作用

牛血清白蛋白中含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基[2]，其相對(duì)強(qiáng)度之比為100∶9∶0.51[3]，所以蛋白具有內(nèi)源熒光，其熒光主要來(lái)自色氨酸殘基，該殘基位于BSA的疏水腔內(nèi)。當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm時(shí)，通常認(rèn)為蛋白質(zhì)的色氨酸和酪氨酸產(chǎn)生熒光。

在濃度固定的BSA溶液中，依次加入不同體積(0、2.5、5、10、15、20、25、30 μL)的硫普羅寧溶液，按實(shí)驗(yàn)方法測(cè)得硫普羅寧對(duì)BSA的熒光猝滅光譜見(jiàn)圖1。在此過(guò)程中,最大發(fā)射峰位于340 nm且保持不變。在激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm時(shí)，BSA的最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)為340 nm。在BSA溶液中，隨著硫普羅寧濃度的增加，BSA熒光發(fā)射峰強(qiáng)度有規(guī)律地降低，說(shuō)明體系對(duì)BSA的內(nèi)源熒光有猝滅作用。

圖1 硫普羅寧對(duì)BSA的熒光猝滅作用

2.2 熒光猝滅作用的Stern-Volmer分析

含色氨酸殘基的蛋白質(zhì)的內(nèi)源性熒光及其變化直接反映了蛋白質(zhì)中色氨酸殘基本身和周?chē)挠H水性和疏水性的變化。在有其它物質(zhì)存在時(shí)，熒光給體的熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象稱(chēng)作熒光猝滅,如藥物存在情況下也會(huì)發(fā)生熒光猝滅。假設(shè)硫普羅寧對(duì)BSA熒光的猝滅是由于猝滅劑分子與BSA分子相互碰撞而引起的動(dòng)態(tài)猝滅，式(1)為Stern-Volmer[4]方程：

F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+Ksv[Q]

(1)

采集295K和299K溫度下硫普羅寧對(duì)BSA熒光猝滅光譜中340 nm處各曲線的熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，并求出(F0-F)/F(F0和F分別為不加入和加入硫普羅寧時(shí)BSA的熒光強(qiáng)度)，經(jīng)過(guò)線性擬合得圖2。由方程斜率求得猝滅速率常數(shù)為：T=295K，Ksv=4.79×102L/mol,Kq=4.79×1010L/(mol·s)；T=299K，Ksv=1.47×103L/mol,Kq=1.47×1011L/(mol·s)。結(jié)果顯示硫普羅寧對(duì)BSA的猝滅速率常數(shù)大于各類(lèi)猝滅劑對(duì)生物大分子最大擴(kuò)散碰撞猝滅速率常數(shù)2.0×1010L/(mol·s)[5]，但與該值相差不大，考慮到猝滅常數(shù)隨溫度升高而升高，推斷硫普羅寧對(duì)BSA的猝滅是動(dòng)態(tài)猝滅與靜態(tài)猝滅[6]相結(jié)合的結(jié)果。

圖2 硫普羅寧對(duì)BSA熒光猝滅的Stern-Volmer分析

2.3 硫普羅寧與BSA的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

藥物與血清蛋白存在的非共價(jià)作用，一般采用位點(diǎn)結(jié)合模型解釋。設(shè)硫普羅寧與BSA形成n個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的復(fù)合物，且這種復(fù)合物無(wú)熒光，則可推導(dǎo)得求算結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n見(jiàn)式(2)：

(2)

在此，K表示某類(lèi)結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合常數(shù)；n表示一個(gè)BSA中某類(lèi)結(jié)合位點(diǎn)能夠結(jié)合的小分子數(shù)目，即結(jié)合位點(diǎn)數(shù)；[Q]表示游離小分子濃度，在研究中通常以其總濃度代替。

2.4 硫普羅寧與BSA的結(jié)合力

藥物小分子與生物大分子的作用力包括氫鍵、范德華力、靜電引力、疏水作用力等，不同藥物與牛血清白蛋白作用力類(lèi)型不同。當(dāng)溫度變化不大時(shí)，反應(yīng)的焓變可以視作常數(shù)。根據(jù)Van′t Hoff熱力學(xué)方程[7][見(jiàn)(3)式和(4)式]可以計(jì)算出藥物小分子與生物大分子作用間的有關(guān)熱力學(xué)常數(shù)：

ΔG=-RTlnK=ΔH-TΔS

(3)

ln(K2/K1)=(1/T1-1/T2)ΔH/R

(4)

ΔH、ΔG、ΔS分別表示焓、自由能和熵的變化。K為表觀結(jié)合常數(shù)，R為摩爾氣體常數(shù)。根據(jù)295K和299K兩個(gè)溫度下的結(jié)合常數(shù)可以計(jì)算出硫普羅寧與BSA相互作用的熱力學(xué)函數(shù)值，結(jié)果列于表1。

表1 硫普羅寧與BSA相互作用的相關(guān)熱力學(xué)參數(shù)

Ross等根據(jù)大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果總結(jié)出判斷生物大分子與小分子結(jié)合性質(zhì)的熱力學(xué)規(guī)律[2]，即ΔH>0，ΔS>0主要表現(xiàn)為疏水作用力；ΔH<0，ΔS<0主要表現(xiàn)為氫鍵和范德華力；ΔH<0，ΔS>0主要表現(xiàn)為靜電作用力。據(jù)此可以判斷，硫普羅寧與BSA的結(jié)合是一個(gè)自發(fā)過(guò)程(ΔG<0)，而它與BSA結(jié)合的ΔH>0，ΔS>0，說(shuō)明該體系中硫普羅寧與BSA之間的主要作用力是疏水作用；反應(yīng)的ΔH>0，表明反應(yīng)為吸熱反應(yīng)。

2.5 同步熒光研究硫普羅寧對(duì)BSA構(gòu)象的影響

同步熒光光譜可用來(lái)判斷發(fā)射團(tuán)周?chē)h(huán)境的極性是否發(fā)生變化。激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)差是一個(gè)重要的參數(shù)。同步熒光光譜法可被用于蛋白質(zhì)構(gòu)象的分析，主要是基于Δλ的變化來(lái)加以考察[8]。蛋白質(zhì)的熒光主要來(lái)自色氨酸、酪氨酸殘基，氨基酸殘基的最大熒光波長(zhǎng)與其所處環(huán)境的疏水性有關(guān)[9]。在同步熒光光譜中，根據(jù)Miller建議，激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)的差值(Δλ)不同，反映不同熒光團(tuán)的光譜。當(dāng)Δλ=15 nm時(shí)，所得同步熒光光譜只顯示酪氨酸殘基的特征熒光；Δλ=60 nm時(shí)，所得同步熒光光譜只顯示色氨酸殘基的特征熒光[10]。而色氨酸、酪氨酸殘基的最大發(fā)射波長(zhǎng)與其所處的微環(huán)境緊密相關(guān)，因此可以據(jù)此考察蛋白質(zhì)構(gòu)象變化情況。

固定BSA的濃度，逐漸增加硫普羅寧的濃度，繪制BSA的同步熒光光譜,分別為酪氨酸和色氨酸殘基的熒光光譜。結(jié)果表明,BSA的熒光主要由色氨酸殘基所貢獻(xiàn),且隨硫普羅寧濃度的增大,色氨酸和酪氨酸殘基的同步熒光光譜的最大波長(zhǎng)分別為286 nm和280 nm,并保持不變,表明在研究的范圍內(nèi),硫普羅寧的加入沒(méi)有引起B(yǎng)SA的構(gòu)象變化。而從熒光猝滅的幅度看,Δλ=15 nm和Δλ=60 nm的熒光降幅分別為21.6%和26.0%，相差不大,說(shuō)明硫普羅寧與BSA的作用可能為非特異結(jié)合。

2.6 甘草次酸和金屬離子對(duì)硫普羅寧與BSA結(jié)合的影響

從臨床醫(yī)學(xué)和藥學(xué)的角度考慮，若金屬離子的存在使藥物在血漿中的貯留時(shí)間相應(yīng)延長(zhǎng)，藥物釋放得更緩慢，藥效更持久。本實(shí)驗(yàn)考察了一些常見(jiàn)金屬離子和治療乙肝的藥物甘利欣的體內(nèi)代謝產(chǎn)物甘草次酸(GA)對(duì)硫普羅寧與BSA結(jié)合的影響，試驗(yàn)在299K下進(jìn)行，結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明，在Mg2+、Mn2+、Cu2+存在的情況下，減小了藥物與蛋白質(zhì)間的結(jié)合常數(shù)，Mn2+存在使得結(jié)合常數(shù)明顯減?。辉贑o2+、Zn2+、GA存在的情況下，卻增大了藥物與蛋白質(zhì)間的結(jié)合常數(shù)，GA存在使得結(jié)合常數(shù)明顯增大?？紤]到硫普羅寧與BSA結(jié)合常數(shù)很小，這些物質(zhì)的共存不會(huì)對(duì)其藥效產(chǎn)生大的影響。

表2 金屬離子和GA對(duì)硫普羅寧與BSA結(jié)合常數(shù)的影響

注：K′表示有干擾的表觀結(jié)合常數(shù)值；K表示沒(méi)有干擾的表觀結(jié)合常數(shù)值。

3 結(jié)論

采用熒光技術(shù)研究了硫普羅寧與BSA之間結(jié)合作用,得到了反應(yīng)的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合熱力學(xué)性質(zhì)和結(jié)合位點(diǎn)等參數(shù)。根據(jù)熱力學(xué)常數(shù)確定了該藥物與血清白蛋白之間的作用力類(lèi)型，并探究金屬離子的介入對(duì)硫普羅寧與牛血清白蛋白的結(jié)合影響，結(jié)果將有助于深入了解硫普羅寧在動(dòng)物體內(nèi)結(jié)合、運(yùn)輸、排泄和毒理。

[1] 周秀清,程建華,孫磊，等.用光譜法研究異鼠李素與牛血清白蛋白的相互作用及幾種金屬離子對(duì)反應(yīng)的影響[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(理學(xué)版),2008,46(5):983-986.

[2] 張曉星,何苗,劉愛(ài)林，等. 熒光法對(duì)姜黃素與牛血清白蛋白相互作用的研究[J].光譜實(shí)驗(yàn)室,2010,27(2):395-401.

[3] 陳國(guó)珍，黃賢智，許金鉤，等.熒光分析法[M].第2版.北京:科學(xué)出版社，1990:65-68.

[4] 楊頻,高飛.生物無(wú)機(jī)化學(xué)原理[M].北京:科學(xué)出版社,2002:164.

[5] 陳寧生,鄭欣,傅應(yīng)強(qiáng).熒光法研究阿維菌素與血清蛋白的作用[J]. 分析化學(xué), 2009, 37(A01):278.

[6] 安普麗,張劍,蔣曄，等.熒光猝滅法研究A1受體拮抗劑與牛血清白蛋白的相互作用[J].華西藥學(xué)雜志,2008，23(1)：37-40.

[7] 孟麗艷,屈凌波,楊冉，等.紫外吸收光譜和熒光光譜法研究大黃酚與牛血清白蛋白相互作用機(jī)制[J].理化檢驗(yàn)：化學(xué)分冊(cè)，2009,45(10)：45-48.

[8] 費(fèi)燕,陸國(guó)才,范國(guó)榮，等.西那沙星與牛血清白蛋白的相互作用及共存金屬離子影響的研究[J].光譜學(xué)與光譜分析,2008,28(11):2 609-2 614.

[9] 汪雙雙，倪永年.光譜法研究11-羥基喜樹(shù)堿與牛血清白蛋白的相互作用[J].分析試驗(yàn)室,2010,29(1):10-13.

[10] 張根成,許潔艷.Cr(VI)與牛血清白蛋白的相互作用[J].應(yīng)用化學(xué),2010，27(2)：192-196.