昆明10種草坪草的ISSR指紋圖譜構(gòu)建

王開拓　吳田　藍增全

摘要：草坪業(yè)在發(fā)展過程中出現(xiàn)一些種的混淆，為了區(qū)分不同草坪草，采用昆明常見的10種草坪草為樣本，利用簡單重復(fù)序列（inter-simple sequence repeat，簡稱ISSR）分子標記技術(shù)構(gòu)建昆明地區(qū)常見草坪草的指紋圖譜。從28條引物中篩選出15條特異性較好的引物，對其進行退火溫度篩選。結(jié)果表明，引物UBC834、UBC842、UBC844退火溫度分別為58、58、55 ℃時多態(tài)性較好。對引物UBC834、UBC842、UBC844的電泳圖譜進行0、1讀帶，構(gòu)建了3個草坪草的數(shù)字指紋圖譜，可以將供試的10種草坪草全部區(qū)分開來。

關(guān)鍵詞：草坪草;ISSR;指紋圖譜;多態(tài)性

中圖分類號：S688.401

文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）02-0073-04

收稿日期：2019-07-15

作者簡介：王開拓（1992—），男，安徽淮南人，碩士研究生，主要從事植物遺傳與種質(zhì)資源研究。E-mail：809271790@qq.com。

通信作者：吳 田，博士，副教授，主要從事植物分子生物學(xué)研究，E-mail：461257271@qq.com;藍增全，碩士，教授，主要從事生態(tài)學(xué)研究，E-mail：kmlanzengquan@qq.com。

近年來草坪業(yè)在我國發(fā)展迅猛，特別是在城市綠化和一些運動場中應(yīng)用極為廣泛，對人類賴以生存的生活環(huán)境起著保護、美化和改善作用。而昆明地處我國西南地區(qū)，氣候獨特，四季如春，素有“春城”的美稱。陳蘊等對我國草坪草的引種工作和一些主要問題進行了綜述和分析[1]。彭燕等以我國主要草坪草的研究進展為基礎(chǔ)，提出研究和利用草坪草種質(zhì)資源的對策[2]。黃鶴平等選用10個草坪草品種進行栽培研究，對昆明地區(qū)的草坪草引種進行了評價[3]。昆明市對城市的美化正在不斷地加強，對草坪草的數(shù)量和質(zhì)量要求也不斷提高。但是，由于草坪草經(jīng)修剪后通常葉色、葉寬、葉片硬度等均會發(fā)生變化，且沒有花序，因此難以通過植物學(xué)性狀區(qū)分草種，不利于有針對性地對草坪進行養(yǎng)護管理。而通過構(gòu)建某一地區(qū)常見的草坪草DNA指紋圖譜，為后續(xù)的草種分辨提供了途徑。

微衛(wèi)星DNA（simple sequence repeats，簡稱SSR）、限制性長度片段多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，簡稱RFLP）、隨機擴增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNA，簡稱RAPD）等分子自標記技術(shù)均可以構(gòu)建指紋圖譜，它們都從不同的角度反映物種的遺傳信息[4-7]。簡單重復(fù)序列（inter-simple sequence repeat，簡稱ISSR）是一種基于PCR擴增進行檢測的分子標記技術(shù)，它對簡單重復(fù)序列之間的區(qū)域進行多態(tài)性擴增，是由Zietkiewicz等[8]提出的。ISSR結(jié)合了其他分子標記技術(shù)的特點，如操作簡單、穩(wěn)定性好、多態(tài)性豐富、成本低等[9-10]，為指紋圖譜的構(gòu)建提供了快速可靠的技術(shù)基礎(chǔ)。指紋圖譜是品質(zhì)混雜的檢測工具[11]，利用ISSR分子標記技術(shù)構(gòu)建指紋圖譜在品種鑒定上的應(yīng)用越來越廣泛，前人已經(jīng)在蘋果[12]、桑樹[13]、鳳梨[14]、復(fù)烤煙[15]等多種植物材料上建立了指紋圖譜。在草坪草上，劉君等利用ISSR標記技術(shù)對9份狗牙根的遺傳多樣性進行了研究，構(gòu)建了9份材料的指紋圖譜[16]。胡雪華等以上海結(jié)縷草（Zoysia japonica）JD-1和細葉結(jié)縷草（Zoysia tenuifolia）、溝葉結(jié)縷草（Zoysia matrella）、結(jié)縷草為材料，利用ISSR分子標記技術(shù)在4個材料中構(gòu)建了指紋圖譜[17]。本試驗以昆明常見的10種草坪草為材料，利用ISSR分子標記技術(shù)構(gòu)建指紋圖譜，為后續(xù)從分子角度對其進行相互區(qū)分奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用草坪草材料分別為溝葉結(jié)縷草[Zoysia matrella （L.） Merr.]、結(jié)縷草（Zoysia japonica Steud.）、細葉結(jié)縷草（Zoysia tenuifolia Willd. ex Trin.）、黑麥草（Lolium perenne L.）、高羊茅（Festuca elata）、草地早熟禾（Poa pratensis L.）、紫羊茅（Festuca rubra L.）、細弱剪股穎（Agrostis tenuis Sibth.）、匍匐剪股穎（Agrostis stolonifera）和狗牙根[Cynodon dactylon （L.） Pers.]。將其種子在西南林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院實驗室溫室培養(yǎng)箱中于 25 ℃ 光照培養(yǎng)發(fā)芽。

1.2 DNA提取與檢測

每個草坪草品種剪下由多顆種子萌發(fā)的幼嫩葉片進行液氮研磨，使用TIANGEN試劑盒提取總DNA。對提取的DNA原液進行1.0%瓊脂糖凝膠、GoldView核酸染料電泳，檢測其質(zhì)量。保存在 -20 ℃ 冰箱中。

1.3 ISSR-PCR反應(yīng)體系及擴增條件

本試驗所用PCR反應(yīng)體系為25 μL：ddH2O 18 μL，dNTP 2 μL，10×Buffer 2.5 μL，DNA模板100 ng，引物10 μmol/L，Trans Taq DNA聚合酶 0.5 μL。擴增程序為94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性60 s，55 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，40個循環(huán);72 ℃ 再延伸10 min，4 ℃保存。

ISSR引物篩選。PCR反應(yīng)結(jié)束后，將擴增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳中檢測。電泳條件為上樣量 3 μL，1×TAE緩沖液，90 V電壓下45 min。電泳結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng)上觀測、拍照。用10個草種樣本從28條引物（表1）中篩選出條帶清晰、多態(tài)性高以及重復(fù)性好的引物。