川芎嗪對隱睪固定術(shù)大鼠生精細(xì)胞影響的實(shí)驗研究

黃建洪 張春陽 姜華茂 尹壽杰

[摘要]目的：觀察睪丸固定術(shù)前使用鹽酸川芎嗪(Ligustrazine Hydrochloride)是否對大鼠隱睪所致的生精細(xì)胞凋亡有協(xié)同保護(hù)作用。方法：22日齡雄性SD大鼠40只，隨機(jī)分成4組，假手術(shù)組(A組)、隱睪組(B組)、睪丸固定術(shù)組(C組)、固定術(shù)+川芎嗪組(D組)，制作大鼠隱睪模型，D組注射鹽酸川芎嗪。14d后，C組和D組行睪丸下降固定術(shù)。28 d后測定睪丸組織中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)的含量，TUNEL法測定生精細(xì)胞的凋亡指數(shù)。結(jié)果：固定術(shù)+川芎嗪組隱睪睪丸內(nèi)SOD活性增強(qiáng)，MDA含量明顯下降，生精細(xì)胞凋亡指數(shù)進(jìn)一步減低。結(jié)論：睪丸下降固定術(shù)能夠減輕大鼠睪丸生精細(xì)胞的凋亡，而固定術(shù)前使用川芎嗪對隱睪所致的睪丸生精細(xì)胞凋亡有協(xié)同保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞]隱睪；睪丸固定術(shù)；生精細(xì)胞；凋亡；川芎嗪；Bcl-2／Bax

[中圖分類號]R588.1[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A[文章編號]1674-4727(2009)11(b)-015-02

臨床上對隱睪的治療，手術(shù)以將睪丸復(fù)位至陰囊為主，藥物以人絨毛膜促性腺激素促睪丸發(fā)育與下降為主，對睪丸損傷，生精細(xì)胞凋亡保護(hù)方面的藥物研究較少，臨床上有未及時手術(shù)和高位腹腔隱睪患者，這些患者或已有睪丸損傷，即使通過手術(shù)將睪丸固定到陰囊內(nèi)，也面臨著成年后不育率升高的風(fēng)險。本實(shí)驗擬通過睪丸固定術(shù)前使用川芎嗪對隱睪大鼠生精細(xì)胞凋亡的影響，觀察川芎嗪是否對隱睪所致的睪丸損傷、睪丸生精細(xì)胞凋亡有協(xié)同保護(hù)作用。

1材料與方法

1.1實(shí)驗動物分組

實(shí)驗分4組：假手術(shù)組(A組)、隱睪組(B組)、睪丸固定術(shù)組(C組)、固定術(shù)+川芎嗪組(D組)，每組大鼠各10只。雄性SD大鼠，日齡22d，體重50～60g。由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗動物中心提供。

1.2動物模型的建立

手術(shù)于遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗動物中心手術(shù)室進(jìn)行，除A組外，各組在大鼠22日齡時制作單側(cè)隱睪模型，10％水合氯醛0.3 ml／kg腹腔麻醉，腹正中切口，切斷左側(cè)睪丸引帶，用7-0無創(chuàng)傷線將左側(cè)睪丸固定于后腹壁。A組只牽拉左側(cè)睪丸引帶，不切斷，用7-0無創(chuàng)傷線縫睪丸引帶一針并結(jié)扎，立即將睪丸還納至陰囊，分兩層關(guān)腹。其中，D組模型制作后，腹腔注射鹽酸川芎嗪，劑量25 mdkg，1次／d，連用2周。其他組注射同等劑量的生理鹽水。隱睪模型術(shù)后14 d，C組和D組行睪丸下降固定術(shù)。腹腔麻醉后，下腹正中切口，將睪丸游離后還至陰囊，用7-0無創(chuàng)傷線將睪丸固定于陰囊內(nèi)膜上。

1.3標(biāo)本收集及處理

在睪丸固定術(shù)后第28天(即大鼠64日齡時)，用快速脫頸椎法處死所有大鼠，留取左側(cè)睪丸，電子天平稱重后制作石蠟切片，部分組織用于測定超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量。

1.4SOD、MDA的測定

采用南京建成生物工程研究所提供的SOD、MDA試劑盒，用化學(xué)比色法，通過分光光度計比色，計算SOD、MDA的含量。

1.5TUNEL法原位細(xì)胞凋亡檢測

用生物素-dUTP／酶標(biāo)親和素測定法檢測睪丸生殖細(xì)胞凋亡(TUNEL法)，方法及步驟嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行，試劑購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。陰性對照組不加末端轉(zhuǎn)移酶，凋亡細(xì)胞胞核呈棕褐色。每個標(biāo)本計數(shù)50個生精小管截面中的凋亡細(xì)胞，計算每個生精小管截面的平均凋亡細(xì)胞數(shù)。

1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

采用單因素方差分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)差來表示。應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，組間比較采用SNK-q檢驗法，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義，以P<0.01表示差異有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組大鼠左側(cè)爭丸MDA含量和SOD活性的變化

睪丸固定術(shù)后28d，與A組相比，B組隱睪睪丸SOD活性下降，MDA含量增高(P<0.01)。與B組相比，C組隱睪睪丸SOD活性增加，MDA含量下降(P<0.01)，但仍高于A組(P<0.05)。與C組相比，D組SOD活性進(jìn)一步增加，MDA含量下降(P<0.01)，與假手術(shù)組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2TUNEL法檢測生精細(xì)胞凋亡指數(shù)

C組生精小管內(nèi)凋亡細(xì)胞較B組明顯減少，但凋亡指數(shù)仍略高于A組。而D組生精小管內(nèi)凋亡細(xì)胞相對較少，凋亡指數(shù)低于C組(P<0.01)，與A組相比，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，且生精小管內(nèi)生精細(xì)胞的數(shù)量明顯增多。

3討論

臨床對隱睪的治療以手術(shù)將異位睪丸復(fù)位至溫度適宜的陰囊為主，手術(shù)應(yīng)盡早進(jìn)行。隱睪患兒在出生后2年內(nèi)生精小管就開始萎縮，精原細(xì)胞數(shù)呈進(jìn)行性減少。有研究表明，如果在2歲之前進(jìn)行睪丸固定術(shù)，生育率能恢復(fù)到87.5％，而如果在13歲或者更晚的時候進(jìn)行，其生育率則下降到14％。另有研究顯示，單側(cè)隱睪患兒在9個月齡進(jìn)行睪丸固定術(shù)，睪丸發(fā)育明顯優(yōu)于在3周歲時手術(shù)患兒。有研究表明，睪丸下降固定能使大鼠隱睪恢復(fù)正常的生精過程，在性成熟之前，隱睪下降固定能促進(jìn)生精過程的恢復(fù)和逆轉(zhuǎn)生殖細(xì)胞的退化；然而對于成年的大鼠隱睪，下降固定不能恢復(fù)其正常的生精過程。

Rusnack等研究發(fā)現(xiàn)，高位型隱睪固定術(shù)患者的睪丸活檢均為重度受損，雙側(cè)隱睪即使早期治療，不育率仍大于60％，單側(cè)隱睪不育率達(dá)25％。熱作用后，除了較早一段時期對精母細(xì)胞、精子細(xì)胞及精子的影響外，長時期內(nèi)精原細(xì)胞的再生能力受到影響，在恢復(fù)期精原細(xì)胞比正常情況下的精原細(xì)胞凋亡增加。因此，隱睪會使睪丸生精細(xì)胞凋亡增加，隱睪下降固定能通過減少生精細(xì)胞凋亡而改善生精功能，部分隱睪固定術(shù)后仍不能完全恢復(fù)生育力可能與生精細(xì)胞凋亡仍較正常睪丸高有關(guān)。

川芎嗪是從川芎中提取一種生物堿單體：4-甲基吡嗪，可以保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，還可以增強(qiáng)SOD及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)的活力，促進(jìn)纖維蛋白溶解17，具有直接清除氧自由基及促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞合成一氧化氮(No)作用。本實(shí)驗說明川芎嗪抑制了生精細(xì)胞凋亡，促進(jìn)了隱睪睪丸生精功能的改善，為臨床上隱睪的治療提供新的思路。