生物玻片標本的制作技巧

摘要： 在生物實驗教學中常用的生物玻片標本制作方法有涂片法、裝片法、切片法等。本文對常用的生物玻片標本的制作技巧進行了總結(jié)，以提高生物實驗教學水平。

關(guān)鍵詞： 生物實驗教學 生物玻片標本 制作技巧

在生物實驗教學和課外科技活動中，經(jīng)常需要制作生物玻片標本。筆者在長期的工作實踐中積累了一定的經(jīng)驗，現(xiàn)把生物玻片標本的制作技巧總結(jié)如下：

1.玻片的清洗

玻片的清潔將直接影響到制片質(zhì)量，所以制作玻片標本的第一步是要對載玻片和蓋玻片進行清潔處理。

1.1新購買的玻片不能直接使用，要先浸泡于95%酒精中，以去除表面的附著物質(zhì)，臨用前取出，晾干或烘干備用。

1.2使用過的舊玻片，先用肥皂水或洗衣粉水煮沸0.5h，冷卻后用軟毛刷刷掉臟物，用流水沖洗干凈后，置于95%酒精中備用。如果是石蠟切片可先放于二甲苯（可用制片時回收的廢棄二甲苯，既避免污染環(huán)境又節(jié)省實驗成本）中浸泡數(shù)小時，把封片用的樹膠溶解掉，將蓋玻片和載玻片分開后，再用肥皂水煮沸。對于很臟的舊玻片可先用洗液浸泡24h（洗液配制：取重鉻酸鉀50g，加水300ml，加熱攪拌溶解，待其冷卻后，徐徐注入濃硫酸250ml，邊加邊攪拌即成，可長期使用），取出用自來水沖洗干凈后，置于95%酒精中備用。

2.涂片的制作

2.1取材要快速，避免發(fā)生細胞自溶現(xiàn)象；操作要輕巧，防止損傷細胞結(jié)構(gòu)。

2.2涂片要均勻，厚薄要適度，太厚細胞堆疊，太薄細胞過少，都會影響觀察。操作時，以在載玻片上涂上淡淡的一層樣品為宜。如果樣品細胞密度過大，如精液過濃可用生理鹽水稀釋后再做涂片。

2.3制作血涂片時，須用雙蒸水，否則易引起染料沉淀；Giemsa染液對酸堿度極敏感，當染液偏酸時，紅細胞染成紅色，偏堿時則染成藍色，所以最好用pH6.8—7.0的緩沖液來配制染液。

3.裝片的制作

3.1在觀察動物組織細胞的臨時裝片時，為保持細胞的正常形態(tài)，應根據(jù)動物種類的不同使用相應的生理鹽水。如哺乳類等溫血動物用0.9%生理鹽水，兩棲類等冷血動物用0.65—0.7%生理鹽水，無脊椎動物用0.45%生理鹽水，海產(chǎn)無脊椎動物可用過濾海水。

3.2染色可使觀察更清楚，除了碘液（碘0.5g、碘化鉀1g、水150ml）以外，還可用1%美藍或甲基綠（0.5%甲基綠100ml，醋酸1ml）染色。

3.3制作半永久裝片，可用甘油封片。將固定、染色過的標本放入5%甘油中，用紗布封口，放在陰涼處2—3天，使水分蒸發(fā)、甘油變濃后，吸一滴帶有標本的甘油于載玻片上，蓋上蓋玻片。對于怕壓、易碎的標本，可在甘油的兩邊放兩根細玻璃絲，再加蓋玻片。

3.4制作永久裝片，一般用樹膠封片。封片前，要先將固定、染色過的標本經(jīng)各級酒精及兩次純酒精脫水、每級15min，然后用酒精二甲苯等混液、兩次純二甲苯透明各15min。處理小型的浮游生物，在換液時可離心，使其沉淀，便于操作。

4.切片的制作

4.1徒手切片

在常規(guī)的徒手切片制作中，效果不好控制，且易切傷手指?？蓪U棄的唇膏盒廢物利用，清洗干凈后，切削合適的蘿卜、土豆等作為夾持物插入盒內(nèi)，旋轉(zhuǎn)盒底，夾持物及材料可隨意升降，用刀片沿管口平切，即可獲理想切片。

4.2石蠟切片

4.2.1多采用Bouin氏液（苦味酸飽和水溶液75ml+福爾馬林25ml+冰醋酸5ml）固定24h后，移入70%酒精保存。如需長期保存，可在70%酒精中加入10%甘油，以避免標本發(fā)脆。

4.2.2在脫水換液時，可用吸水紙將標本表面水分輕輕蘸掉，再投入到下一級高濃度酒精中，這樣可提高脫水效果。

4.2.3透明時如果室溫較低，可適當延長時間或置于溫箱中加熱。

4.2.4浸蠟要選用適當熔點的石蠟，一般春秋季室溫20℃左右時，用熔點52—54℃的石蠟，冬季用熔點45—50℃的石蠟，夏季用熔點56—58℃的石蠟。用過的蠟可收集起來熔化過濾后再次使用，并且舊蠟比新蠟還好用。浸蠟時要控制好蠟溫，溫度過高會使組織燙壞，操作時注意以蠟缸邊緣有少量蠟凝固為宜。

4.2.5對于卵黃多的材料如蛙卵、魚卵等，采用常規(guī)的制片方法不易成功。筆者對脫水、透明和浸蠟等關(guān)鍵步驟進行了改進，效果良好，具體為：將固定后、保存于70%酒精的標本移入80%酒精1h→95%酒精+氯仿+冰醋酸混合液1h（95%酒精與氯仿體積比1∶1，每100ml加5ml冰醋酸）→叔丁醇+氯仿+冰醋酸混合液1h（叔丁醇與氯仿體積比1∶1，每100ml加5ml冰醋酸）→松油醇1h→松油醇與石蠟1∶1混合液30min→石蠟Ⅰ30min→石蠟Ⅱ30min→石蠟Ⅲ4—5h。

4.2.6蠟塊修整時，從標本的四周距離蠟塊邊緣要有2—3mm，修整成長方體或正方體以利于切片時能連成蠟帶。夏季室溫過高，可將蠟塊放于冰箱中保存，以保持硬度，切時取出。切片刀要鋒利且潔凈。

4.2.7蘇木精與伊紅（HE）染色法最關(guān)鍵的步驟是分色。蘇木精染色后的切片呈深紫紅色，在分色時可經(jīng)常取出切片，背面襯一張白紙對著光線看，當切片褪色至淺紫紅色即可。初學者須用顯微鏡檢查，鏡下細胞核結(jié)構(gòu)清晰即停止分色。

4.3冰凍切片

4.3.1根據(jù)所切材料的性質(zhì)，調(diào)節(jié)所需的溫度。腦、淋巴結(jié)、甲狀腺、肝臟、脾、骨髓等，適宜溫度為：0—-15℃；舌、肌肉、腸、胰臟、前列腺、子宮、卵巢等，適宜溫度為：-15—-30℃；脂肪宜用-30—-60℃。

4.3.2材料的冰凍程度要掌握好。冰凍過度，切片易碎也易損傷刀口；冰凍不足切片會呈粥糜狀。冰凍適度時，組織塊上端的白霜即漸消失，和刀接觸時，發(fā)出嘶嘶細小的聲音，并有輕度阻力感覺，切出的切片大部分都能卷附在切片刀上，如連續(xù)地進行切削，切片能連接起來，自下而上卷轉(zhuǎn)，投入水中，好的切片即能自然伸展開來，絲毫看不到有條紋和傷痕。

4.3.3切片的動作要敏捷，因為冰融會影響切片。如遇切片破碎時，宜檢查組織塊中部，若中部還軟，說明冰凍不足，應繼續(xù)冰凍；如冰凍過硬，稍等片刻再切，如仍切碎或不完整，應檢查刀口，更換位置再切片。

4.3.4冰凍切片可以不貼片進行染色，也可貼片后染色。如果操作細致，不加貼附劑切片亦可粘牢于玻片上。如果切片易脫落，可先在玻片上涂一薄層蛋白甘油，然后將玻片插入水中用彎頭小玻棒幫助把切片撈起，擺正位置，放于37℃溫箱內(nèi)烘干，入70%酒精5min，即可染色。

參考文獻：

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基金項目：淮海工學院教學改革立項課題（2006106）