蒿芩清膽加減方含藥血清誘導(dǎo)Ｌｅｗｉｓ肺癌細(xì)胞分化研究

杜垚森　黃秀深　胡雅凌

（成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川,成都,610075）

【摘要】 目的：觀察蒿芩清膽加減方含藥血清對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞的分化誘導(dǎo)作用,并初步探索其作用機(jī)制。方法：蒿芩清膽加減方含藥血清,體外培養(yǎng)Lewis肺癌細(xì)胞,通過不同濃度血清作用于細(xì)胞進(jìn)行干預(yù).觀察給藥后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。用MTT抑瘤實(shí)驗(yàn),琥珀酸脫氫酶（SDH）,乳酸脫氫酶（LDH）的測(cè)定,細(xì)胞周期的測(cè)定,觀察細(xì)胞分化的情況。結(jié)果：光鏡下血清組培養(yǎng)瓶中貼壁細(xì)胞數(shù)量呈減少趨勢(shì),以高劑量組細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量改變趨勢(shì)明顯。MTT比色法顯示含藥血清濃度越高,抑制作用越強(qiáng).SDH活性顯示蒿芩清膽加減方血清組系使Lewis肺癌細(xì)胞內(nèi)的SDH活性明顯上升,并以高劑量組作用最為明顯。LDH活性顯示蒿芩清膽加減方血清高劑量組降低細(xì)胞內(nèi)LDH活性最明顯。結(jié)論：蒿芩清膽加減方含藥血清作用于Lewis肺癌細(xì)胞株后,細(xì)胞具有向正常細(xì)胞生理狀態(tài)分化成熟的趨勢(shì)。

【關(guān)鍵詞】蒿芩清膽加減方；Lewis肺癌細(xì)胞；分化誘導(dǎo)；含藥血清

【中圖分類號(hào)】 R285.5【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】 A【文章編號(hào)】 1005-1074(2009)04-0002-02

蒿芩清膽湯出自《重訂通俗傷寒論》,由青蒿腦、淡竹茹、仙半夏、赤茯苓、青子芩、生枳殼、陳廣皮和碧玉散組成。目前對(duì)該方抗腫瘤研究不多,黃秀深教授經(jīng)過長(zhǎng)期臨床用藥發(fā)現(xiàn),該方在與人參,苦參等益氣扶正,清熱解毒的中藥加減化裁后,對(duì)肺癌,肝癌等各種惡性癌癥有較好的治療效果。為了解其作用機(jī)制,本次實(shí)驗(yàn)以誘導(dǎo)Lewis肺癌細(xì)胞分化進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株 Lewis肺癌細(xì)胞株由成都中醫(yī)藥大學(xué)病理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與藥品 健康SD大鼠,體重200～220g,雌雄各半,由成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號(hào)：川實(shí)動(dòng)管97(質(zhì)8)號(hào)。蒿芩清膽加減方各中藥均購于北京同仁堂成都分店。按常規(guī)煎煮法制成每1ml蒿芩清膽加減方含1g生藥濃度藥液；RPMI1640培養(yǎng)基,GIBCO公司；硝基四唑氮藍(lán)（MTT）,Sigma公司；琥珀酸脫氫酶（SDH）測(cè)試盒,乳酸脫氫酶（LDH）測(cè)試盒,考馬斯亮蘭測(cè)定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.1.3 給藥 將SD大鼠隨機(jī)分為蒿芩清膽加減方大中小劑量3個(gè)組和生理鹽水對(duì)照組,每組12只.依據(jù)文獻(xiàn)^[1],蒿芩清膽加減方按臨床成人（60kg）每天服用生藥10倍給SD大鼠灌胃,即每天給藥劑量＝人每天治療劑量×動(dòng)物等效劑量系數(shù)×10倍。每只每次給藥2ml（每1ml水煎液含1g生藥）,每日2次,連續(xù)3d,生理鹽水對(duì)照組給以同劑量的生理鹽水。

1.1.4 血清的制備 末次灌胃前禁食12h.末次灌胃后1h,股動(dòng)脈采血,靜置2h,3000r/min離心15min，分離血清,經(jīng)56℃,30min滅活處理后,用0.45um微孔濾膜過濾除菌,置－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.5 血清分組 實(shí)驗(yàn)共分為5組.將蒿芩清膽加減方含藥血清分為?。?％）、中（10％）、大（15％）3組；生理鹽水血清組及空白對(duì)照組。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)光鏡觀察 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,以0.5×10⁵個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板,分組加藥,培養(yǎng)6d,常規(guī)Wright－Giemsa染色；油鏡下計(jì)200個(gè)細(xì)胞,觀察其分化成熟度。

1.2.2 MTT抑瘤實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞按2×10³/ml接種于96孔培養(yǎng)板中,每組復(fù)設(shè)6個(gè)平行孔,每孔體積200ul，培養(yǎng)24h后給藥組依次加入小（5％）、中（10％）、大（15％）含藥血清,生理鹽水組加等量生理鹽水血清，空白對(duì)照組加等體積無血清RPMI1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h,加MTT溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后小心吸取培養(yǎng)液,以200ulDMSO溶解結(jié)晶,振蕩10min后上酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)490nm處測(cè)每孔的光吸收值（A）,并求出生長(zhǎng)抑制率。

1.2.3 乳酸脫氫酶（LDH）的測(cè)定 取在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Lewis肺癌細(xì)胞,分組加藥，培養(yǎng)6d后收集細(xì)胞,勻漿機(jī)破碎，在波長(zhǎng)440nm處測(cè)每孔的吸光度,按試劑盒說明操作，按公式計(jì)算細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶活力。

1.2.4 琥珀酸脫氫酶（SDH）的測(cè)定 方法同上,在波長(zhǎng)600nm處測(cè)每孔的吸光度,按試劑盒說明操作，按公式計(jì)算細(xì)胞內(nèi)琥珀酸脫氫酶活力。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的變化 以1×10⁵個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板中,藥物處理細(xì)胞方法同上，細(xì)胞培養(yǎng)6d后,收集細(xì)胞(細(xì)胞數(shù)>10⁶個(gè)),用流式細(xì)胞儀分析。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次.結(jié)果采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,組間計(jì)量資料采用單因素方差分析,計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，顯著性為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 光鏡形態(tài)學(xué)觀察 在倒置顯微鏡觀察下,空白對(duì)照組及生理鹽水血清組：Lewis肺癌細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好,細(xì)胞形態(tài)無明顯改變。蒿芩清膽加減方血清組培養(yǎng)瓶中貼壁細(xì)胞數(shù)量呈減少趨勢(shì)，其中以高劑量組細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量改變趨勢(shì)明顯，處理組部分細(xì)胞脫落,貼壁細(xì)胞漿內(nèi)顆粒多,細(xì)胞界限不清,呈單層細(xì)胞,不重疊，染色后,細(xì)胞著色較一致,細(xì)胞呈多邊形,大小較一致,核仁減少,胞質(zhì)增加,核質(zhì)比例明顯下降，油鏡下200個(gè)細(xì)胞算多核仁數(shù)為：含藥血清高劑量組為9.1％,中劑量組14.8％,低劑量組26.2％,生理鹽水血清組為37.0％，空白組40.1％。

2.2 MTT抑瘤率觀察 蒿芩清膽加減方對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞有抑制作用,含藥血清濃度越高,抑制作用越強(qiáng),以高劑量組作用最強(qiáng),中劑量組次之,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

2.3 蒿芩清膽加減方對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞SDH活性的影響 見表2。

2.4 蒿芩清膽加減方對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞LDH活性的影響 見表3。

2.5 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期 見表4。

3 討論

腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)分化,是指在分化誘導(dǎo)劑的作用下,惡性腫瘤細(xì)胞的形態(tài),生化等方面的諸多標(biāo)志向正常細(xì)胞的方向演化,甚至于完全轉(zhuǎn)化為正常細(xì)胞.作為分化誘導(dǎo)劑,中藥具有毒副作用較小的優(yōu)點(diǎn).但當(dāng)前對(duì)中藥分化誘導(dǎo)研究較少,且多為單味中藥研究.中藥復(fù)方在預(yù)防腫瘤發(fā)生、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)以及抑制腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移等方面的研究已經(jīng)取得了相當(dāng)?shù)倪M(jìn)展，但目前對(duì)中藥復(fù)方誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化的研究并不多。對(duì)于蒿芩清膽湯抗腫瘤研究,特別是對(duì)其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化的作用還沒有開展實(shí)質(zhì)性的研究，導(dǎo)師黃秀深教授根據(jù)長(zhǎng)期臨床工作發(fā)現(xiàn)本方在加減化裁后對(duì)肺癌,肝癌等均有較好療效，因此本實(shí)驗(yàn)選擇蒿芩清膽加減方分化誘導(dǎo)Lewis肺癌細(xì)胞作為研究。

形態(tài)學(xué)上的分化成熟是表明惡性腫瘤細(xì)胞分化的標(biāo)志，腫瘤細(xì)胞的形態(tài)與其相應(yīng)正常細(xì)胞存在較大差別，誘導(dǎo)分化后的腫瘤細(xì)胞喪失其惡性形態(tài)與超微結(jié)構(gòu)特征,向同組織來源的正常細(xì)胞形態(tài)與超微結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，因此考察與鑒定誘導(dǎo)分化處理前后腫瘤細(xì)胞形態(tài)與超微結(jié)構(gòu)特征的變化,歷來都是評(píng)價(jià)外源性物質(zhì)對(duì)腫瘤細(xì)胞是否分化的一個(gè)重要判斷依據(jù)。本次試驗(yàn)顯示,給藥后蒿芩清膽加減方組細(xì)胞排列疏松,且較對(duì)照組收縮變圓；呈單層細(xì)胞,不重疊；染色后,細(xì)胞著色較一致,細(xì)胞呈多邊形,大小較一致；胞質(zhì)增加,核質(zhì)比例明顯下降。由此可知蒿芩清膽加減方含藥血清有誘導(dǎo)Lewis肺癌細(xì)胞向成熟細(xì)胞分化的作用。

乳酸脫氫酶（LDH）和琥珀酸脫氫酶（SDH）均是細(xì)胞內(nèi)代謝標(biāo)志酶,前者與細(xì)胞分化程度呈負(fù)相關(guān),后者則與細(xì)胞分化程度呈正相關(guān)^[2]。蒿芩清膽加減方含藥血清使Lewis肺癌細(xì)胞的SDH的活性明顯增強(qiáng),LDH活性明顯減弱,說明蒿芩清膽加減方能有效使Lewis肺癌細(xì)胞異常的無氧酵解得到抑制,恢復(fù)有氧代謝,從而向正常細(xì)胞分化。

許多誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)了細(xì)胞周期停滯的現(xiàn)象,表明細(xì)胞周期阻抑是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化的一個(gè)重要特征^[3]。大量研究已經(jīng)證實(shí)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)主要是細(xì)胞群主體部分分布于DNA合成的活躍的S期,而分化細(xì)胞群主體分布于DNA合成靜止的G₀/G₁期。蒿芩清膽加減方含藥血清作用于Lewis肺癌細(xì)胞后,細(xì)胞周期呈現(xiàn)阻滯于G₀/G₁期,S期細(xì)胞數(shù)減少,這與多數(shù)腫瘤分化誘導(dǎo)劑作用后細(xì)胞周期的改變一致^[4]。推測(cè)蒿芩清膽加減方是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期,達(dá)到分化誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的作用。但蒿芩清膽加減方含藥血清是通過什么機(jī)制來調(diào)節(jié)細(xì)胞周期？是否是通過抑制CDK或（并）Cyclin的活性,引起Rb蛋白的去磷酸化；或（并）增強(qiáng)了CKI的活性,最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞阻斷在G₀/G₁期、減少S期細(xì)胞還需要進(jìn)一步深入研究。

參考文獻(xiàn)

[1] 李振光,王凈凈.關(guān)于中藥血清藥理學(xué)方法的思考[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2002,（9）2：5

[2] 陳嘯梅.組織化學(xué)工冊(cè)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1982:224.

[3] 孔令華,劉玉琴,等.惡性腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)分化[J].癌癥進(jìn)展雜志,2004.11；02(06).

[4] 宋 莉.人參環(huán)氧炔醇對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2、LEWIS肺癌細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用[J].癌癥,2004,23(8)

(收稿日期：2008.12.10)