辛伐他汀對(duì)鈦顆粒刺激人單核細(xì)胞形成破骨細(xì)胞的影響

王真 高希武 孫克寧 金群華

基礎(chǔ)研究

辛伐他汀對(duì)鈦顆粒刺激人單核細(xì)胞形成破骨細(xì)胞的影響

王真 高希武 孫克寧 金群華

目的研究體外辛伐他汀對(duì)鈦顆粒刺激單核細(xì)胞形成破骨細(xì)胞的影響，探討辛伐他汀防治人工關(guān)節(jié)無(wú)菌性松動(dòng)的可能性。方法體外分離培養(yǎng)人外周血單個(gè)核細(xì)胞并分成5組，A組為鈦顆粒刺激組（單核細(xì)胞和磨屑混合培養(yǎng)），B組為10-5mol/L辛伐他汀組（單核細(xì)胞、磨屑混合培養(yǎng)+10-5mol/L辛伐他?。?，C組為10-6mol/L辛伐他汀組（單核細(xì)胞、磨屑混合培養(yǎng)+10-6mol/L辛伐他?。?，D組為10-7mol/L辛伐他汀組（單核細(xì)胞、磨屑混合培養(yǎng)+10-7mol/L辛伐他?。珽組為單核細(xì)胞組。各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后取上清液，用ELISA法檢測(cè)上清液中腫瘤壞死因子(TNF-α)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）的含量。分別培養(yǎng)10 d、18 d后進(jìn)行TRAP染色陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，采用掃描電鏡檢測(cè)骨磨片的吸收陷窩，觀察鈦顆粒對(duì)破骨細(xì)胞形成的影響。結(jié)果磨屑刺激單個(gè)核細(xì)胞分泌溶骨因子，辛伐他汀抑制磨損顆粒刺激單核/巨噬細(xì)胞分泌TNF-α及MCP-1；且破骨細(xì)胞數(shù)明顯減少，骨吸收陷窩數(shù)減少，與鈦顆粒組刺激組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論辛伐他汀通過(guò)抑制TNF-α、MCP-1的釋放而有效防止磨屑誘導(dǎo)的骨溶解，有望成為防治人工關(guān)節(jié)無(wú)菌性松動(dòng)的一種有潛力的藥物。

辛伐他??；破骨細(xì)胞；單核細(xì)胞；鈦；骨質(zhì)溶解

目前，全世界每年開(kāi)展的關(guān)節(jié)置換手術(shù)超過(guò)100萬(wàn)例，其中大約10%的病人在術(shù)后10年內(nèi)可能發(fā)生假體周圍骨溶解并導(dǎo)致人工關(guān)節(jié)無(wú)菌性松動(dòng)[1]。目前尚無(wú)公認(rèn)的有效藥物能夠預(yù)防或抑制假體周圍骨溶解，而假體遠(yuǎn)期無(wú)菌性松動(dòng)只能通過(guò)關(guān)節(jié)翻修手術(shù)進(jìn)行治療。他汀類藥物(statins)是臨床廣泛應(yīng)用的降低膽固醇的藥物。Mundy等[2]研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物不僅能夠促進(jìn)成骨，而且可使小鼠破骨細(xì)胞減少約25%左右。本文通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究探討辛伐他汀對(duì)鈦顆粒誘導(dǎo)人單核細(xì)胞形成破骨細(xì)胞的影響，進(jìn)一步分析他汀類藥物防治人工關(guān)節(jié)無(wú)菌性松動(dòng)的可能性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

外周血來(lái)源 本組10例均為成年健康志愿者（均已簽署知情同意書(shū)），21～35歲，中位年齡32歲。共抽血45 ml，肝素抗凝，其中3 ml標(biāo)本用于血常規(guī)檢查，白細(xì)胞計(jì)數(shù)均在正常范圍內(nèi)。

1.2 主要試劑及藥品

RPMI-1640培養(yǎng)基（Hyclone公司），胎牛血清（杭州四季青公司），6孔培養(yǎng)板（Corning公司），鈦顆粒（Zimmer公司提供，經(jīng)掃描電鏡掃描證實(shí)90%顆粒＜10 μm，圖1），單核細(xì)胞分離液（購(gòu)自天津?yàn)螅?；辛伐他汀片（Simvastatin Merk sharp& Dohme Ltd.U.K惠贈(zèng)），U0126（購(gòu)自promga公司）；ELISA試劑盒(上海船夫生物公司)；奈酚AS-BI磷酸鈉、酒石酸鉀鈉（購(gòu)自sigma公司）；骨磨片（解放軍301骨研所惠贈(zèng)）；KYKY2800B掃描電鏡（寧夏回族自治區(qū)能源化工重點(diǎn)試驗(yàn)室提供）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 無(wú)菌采集外周血以RPMI-1640液稀釋1倍，分層液梯度離心法分離出單個(gè)核細(xì)胞（3 000轉(zhuǎn)/min，25 min）。毛細(xì)管小心吸取單個(gè)核細(xì)胞，RPMI-1640液洗滌1 000 r/min，10 min，3次；單核細(xì)胞計(jì)數(shù)用流式細(xì)胞染色檢測(cè)抗CD14+陽(yáng)性細(xì)胞為準(zhǔn)。單核細(xì)胞加10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞至1×106/ml，臺(tái)盼蘭檢測(cè)細(xì)胞活力均＞95%。事先將滅菌的6 mm直徑的骨磨片和8 mm直徑的蓋玻片2塊分別放入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，向培養(yǎng)板中滴加細(xì)胞懸液，每孔加3 ml。置37℃、5%CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h，使細(xì)胞貼壁，利用單核細(xì)胞的貼壁性，洗去非貼壁細(xì)胞，留下單核細(xì)胞。每板有1孔加入含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液3 ml，余4孔中加入濃度為0.1%（W/V%）的鈦顆粒懸液1 ml，其中3孔內(nèi)分別加入濃度為10-5、10-6、10-7mol/L的辛伐他汀。實(shí)驗(yàn)分組如下：A組為鈦顆粒刺激組（單核細(xì)胞和磨屑混合培養(yǎng)），B組為10-5mol/L辛伐他汀組（單核細(xì)胞、磨屑混合培養(yǎng)+10-5mol/L辛伐他?。?，C組為10-6mol/L辛伐他汀組（單核細(xì)胞、磨屑混合培養(yǎng)+10-6mol/L辛伐他?。?，D組為10-7mol/L辛伐他汀組（單核細(xì)胞、磨屑混合培養(yǎng)+10-7mol/L辛伐他?。?，E組為單核細(xì)胞組?；靹颍瑮l件培養(yǎng)24 h，留上清液離心后置于－80℃冰箱，用于檢測(cè)細(xì)胞因子。之后每3天更換一次培養(yǎng)液，分別于培養(yǎng)10 d、18 d后進(jìn)行TRAP染色陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)。采用掃描電鏡觀察骨磨片的吸收陷窩。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。以上試驗(yàn)均重復(fù)2次。

圖1 鈦顆粒掃描電鏡結(jié)果（×1 000）

1.3.2 破骨細(xì)胞的鑒定及骨磨片掃描電鏡觀察按文獻(xiàn)[3]描述的抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrateresistant acid phosphatase,TRAP）孵育液配制及染色方法進(jìn)行；光鏡下計(jì)算玻片（1 cm2）TRAP陽(yáng)性破骨細(xì)胞總數(shù)，細(xì)胞核≥3的TRAP染色陽(yáng)性細(xì)胞為破骨細(xì)胞。

骨磨片培養(yǎng)18 d后，棄去培養(yǎng)液，骨片2.5%戊二醛4℃固定10 min，0.5%甲苯胺藍(lán)室溫染色3 min，蒸餾水沖洗后在100倍光鏡下觀察并計(jì)數(shù)，鏡下對(duì)骨吸收陷窩（呈圓形、橢圓形和臘腸形等典型形態(tài)，邊界清楚的藍(lán)紫色異染區(qū)）觀察計(jì)數(shù)，取均值。骨磨片清洗后2.5%戊二醛固定2 h，1%鋨酸固定2 h，系列酒精脫水，醋酸異戊酯置換酒精，二氧化碳臨界點(diǎn)干燥鍍金，掃描電鏡觀察。

1.3.3 細(xì)胞因子的檢測(cè) 上清液解凍后，用ELISA試劑盒檢測(cè)腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α,TNF-α）及單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1,MCP-1）的含量。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s）表示。組間整體比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用SNK-q法，比較辛伐他汀藥物組間破骨細(xì)胞數(shù)及TNF、MCP細(xì)胞因子的差異，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 2A 10 d空白對(duì)照組 2B 10 d鈦顆粒刺激組 2C 10 d 10-7mol/L辛伐他汀干預(yù)組 2D 1 8 d鈦顆粒刺激組 2E 18 d 10-7mol/ L辛伐他汀干預(yù)組 2F 18 d 10-5mol/L辛伐他汀干預(yù)組（TRAP染色，×40）

表1 辛伐他汀對(duì)鈦顆粒刺激單核/巨噬細(xì)胞形成破骨細(xì)胞的比較（n=10，x-±s）

2 結(jié)果

2.1 光鏡及掃描電鏡觀察結(jié)果

如圖2所示，TRAP染色陽(yáng)性的破骨細(xì)胞胞體大，形態(tài)不規(guī)則，胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)較多桔紅色顆粒，核淡染，可見(jiàn)偽足伸出；細(xì)胞培養(yǎng)10 d時(shí)，鈦顆粒刺激組及10-7mol/L辛伐他汀組均有少量破骨細(xì)胞形成，細(xì)胞核數(shù)目較少；細(xì)胞培養(yǎng)至18 d，破骨細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞核數(shù)目明顯增多。各組破骨細(xì)胞形成的比較結(jié)果（表1）提示，A組的破骨細(xì)胞數(shù)明顯多于B、C、D組（P＜0.001），C、D組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)（P=0.078），而B(niǎo)組與C、D組之間有顯著性差異（P＜0.001）；辛伐他汀干預(yù)組與鈦顆粒刺激組相比骨陷窩數(shù)明顯減少（圖3），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果

如表2所示，鈦顆粒刺激組TNF-α及MCP-1的含量明顯高于其它組，差異具有顯著性意義（P＜0.001）；與其他辛伐他汀組比較，鈦顆粒刺激+10-5mol/L辛伐他汀組抑制磨屑刺激人單核/巨噬細(xì)胞分泌TNF-α及MCP-1的過(guò)程呈劑量依賴性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 辛伐他汀對(duì)鈦顆粒刺激單核/巨噬細(xì)胞TNF-α及MCP-1的影響，用OD值表示（n=10，x-±s）

3 討論

圖3 骨片掃描電鏡結(jié)果（×1 000）

手術(shù)技術(shù)、假體設(shè)計(jì)工藝的提高以及高耐磨材料的使用，大大降低了人工關(guān)節(jié)松動(dòng)的發(fā)生率，目前限制該技術(shù)發(fā)展的主要問(wèn)題是假體周圍磨損微粒誘導(dǎo)的骨溶解所導(dǎo)致的假體松動(dòng)。隨著新一代金屬假體的應(yīng)用，金屬磨損產(chǎn)物在人工關(guān)節(jié)無(wú)菌性松動(dòng)中的作用日益受到重視。人工關(guān)節(jié)磨損產(chǎn)物刺激人單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量溶骨性因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6等，其中TNF-α被認(rèn)為是引起骨吸收的最重要的炎性細(xì)胞因子之一[4]。我們以往的研究證實(shí)，鈦顆粒刺激培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞，可以產(chǎn)生大量的TNF-α、IL-1、IL-6[5]。國(guó)外學(xué)者的研究顯示，在骨質(zhì)溶解患者的假體周圍組織中，MCP-1等趨化因子呈陽(yáng)性表達(dá)。將巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、聚甲基丙烯酸甲酯、鈦顆粒進(jìn)行共培養(yǎng)，可以發(fā)現(xiàn)趨化因子表達(dá)增加[6,7]。Kaufman等[8]采用蛋白組學(xué)方法檢測(cè)巨噬細(xì)胞分泌的30種細(xì)胞因子和趨化因子含量，發(fā)現(xiàn)金屬顆粒刺激產(chǎn)生的炎性因子最多，而IL-1、TNF-α和MCP-1被認(rèn)為是骨溶解的始動(dòng)因子，與人工關(guān)節(jié)松動(dòng)假體周圍骨吸收密切相關(guān)。MCP-1促進(jìn)單核/巨噬細(xì)胞合成和分泌TNF-α的特性在體外實(shí)驗(yàn)中也得到證實(shí)，反之，TNF-α亦可刺激單核細(xì)胞分泌MCP-1[9,10]。體外實(shí)驗(yàn)中，激活的淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等多種細(xì)胞均可產(chǎn)生MCP-1，IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性細(xì)胞因子均可促進(jìn)MCP-1表達(dá)，從而加速破骨細(xì)胞形成，參與骨吸收過(guò)程。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)抑制TNF-α、MCP-1表達(dá)以減少破骨細(xì)胞數(shù)目，從而達(dá)到抑制骨溶解的目的。

他汀類藥物即3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A(3-hydroxy-3-methyglutaryl-coenzyme A,HMGCoA)還原酶抑制劑，是廣泛應(yīng)用于臨床的降脂藥物，可通過(guò)抑制HMG-CoA還原酶進(jìn)而減少甲羥戊酸的合成，而甲羥戊酸通路又是N-二膦酸鹽抑制破骨細(xì)胞骨吸收的主要途徑[11]。由此可見(jiàn)，他汀類藥物對(duì)破骨細(xì)胞形成的抑制主要是通過(guò)抑制甲羥戊酸途徑而在膽固醇合成途徑的早期發(fā)揮作用。體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明他汀類藥物可以影響破骨細(xì)胞的骨吸收[12]，近期研究亦表明他汀類藥物可以明顯抑制巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α及MCP-1[13,14]；本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果證實(shí)，辛伐他汀可通過(guò)抑制外周血單核細(xì)胞分泌TNF-α及MCP-1而達(dá)到減少破骨細(xì)胞的形成進(jìn)而抑制骨溶解的作用，有望成為防治無(wú)菌性人工關(guān)節(jié)松動(dòng)的藥物。

1 Keener JD,Callaghan JJ,Goetz DD,et al.Twenty-five-year results after Charnley total hip arthroplasty in patients less than fifty years old:a concise follow-up of a previous report[J].J Bone Joint Surg Am,2003,86-A(6):1066-1072.

2 Mundy G,Garrett R,Harris S,et al.Stimulation of bone formation invitro and in rodents by statins[J].Science,1999, 286(5446):1946-1949.

3 van-de-Wijngaert FP,Burger EH.Demonstration of tartrateresistant acid phosphatase in un-decalcified,glycolmethacrylate-embedded mouse bone:a possible marker for(pre) osteoclast identification[J].J Histochem Cytochem,1986,34 (10):1317-1323.

4 Boyce BF,Li P,Yao Z,et al.TNF-alpha and pathologic bone resorption[J].Keio J Med,2005,54(3):127-131.

5 陳志榮,張亮,吳興臨,等.依那西普對(duì)磨屑誘導(dǎo)骨溶解影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)矯形外科雜志,2008,16(4):285-287.

6 Fritz EA,Glant TT,Vermes C,et al.Titanium particles induce the immediate early stress responsive chemokines IL-8 and MCP-1 in osteoblasts[J].J Orthop Res,2002,20(3):490-498.

7 Fritz EA,Glant TT,Vermes C,et al.Chemokine gene activation in human bone marrow-derived osteoblasts following exposure to particulate wear debris[J].J Biomed Mater Res A, 2006,77(1):192-201.

8 Kaufman AM,Alabre CI,Rubash HE,et al.Human macrophageresponsetoUHMWPE,TiAlV,CoCr,andalumina particles:analysis of multiple cytokines using protein arrays [J].J Biomed Mater Res A,2008,84(2):464-474.

9 Robinson SC,Scott KA,Balkwill FR.Chemokine stimulation of monocyte matrix metalloproteinase-9 requires endogenous TNF-alpha[J].Eur J Immnol,2002,32(2):404-412.

10 Rovin BH,Yoshiumura T,Tan L.Cytokine-induced production of monocyte chemoattractant protein-1 by cultured human mesangial cells,1992,148(7):2148-2153.

11 Cruz AC,Gruber BL.Statins and osteoporosis:can these lipidlowering drugs also bolster bones?[J].Cleve Clin J Med, 2002,69(4):277-288.

12 Staal A,Frith JC,French MH,et al.The ability of statins to inhibit bone resorption is directly related to their inhibitory effect on HMG-CoA reductase activity[J].J Bone Miner Res, 2003,18(1):88-96.

13 Laing AJ,Dillon JP,Mulhall KJ,et al.Statins attenuate polymethylmethacrylate-mediated monocyte activation[J].Acta Orthopaedica,2008,79(1):134-140.

14丁悅,秦礎(chǔ)強(qiáng),馬若凡,等.磨損顆粒刺激巨噬細(xì)胞引起人工關(guān)節(jié)松動(dòng)的作用機(jī)制[J/CD].中華關(guān)節(jié)外科雜志(電子版), 2008,2(4):435-439.

（本文編輯 陳娜）

Effect of simvastatin on inhibiting osteoclasts cytomorphosis from PBMC stimulated by Ti particles

WANGZhen*,GAO Xi-wu,SUN Ke-ning,JIN Qun-hua.*Graduate school ofNingxia Medical University,Yinchuan 750004,China

JIN Qun-hua,E-mail:jinqunhua@sina.com

Objective To investigate the effect of simvastatin on inhibiting osteoclasts cytomorphosis from PBMC stimulated by Ti particles,and the potential prevention effect on the aseptic loosening of prosthesis. Methods In vitro human peripheral blood mononuclear cells(PBMC)were separated,cultured into five groups，as group A:PBMC and Ti particles，group B:PBMC and Ti particles with 10-5mol/L simvastatin，group C: PBMC and Ti particles with 10-6mol/L simvastatin,group D:PBMC and Ti particles with 10-7mol/L simvastatin，group E:PBMC group.The productions of TNF-α and MCP-1 in the suspension of each group were tested by ELISA.After 10 and 18 days incubation,osteoclasts were counted by TRAP-positive staining and their functions were assessed by absorption laeuna using scanning electron microscope(SEM)on the slice.Results The productions of TNF-α,MCP-1 from PBMC stimulated by Ti particles were inhibited when simvastatin was used, the numbers of osteoclasts and absorption laeuna in the treatment groups were lesser than in the Ti induced group (P＜0.05).Conclusion Simvastatin can inhibit bone absorptive factors expression induced by wear particles.As a result,it may be applied to prevent and treat aseptic loosening of prosthesis.

Simvastatin;Osteoclasts;Monocytes;Titanium;Osteolysis

R687.4,R96

A

1674-666X(2009)02-0125-04

10.3969/j.issn.1674-666X.2009.02.012

750004寧夏銀川，寧夏醫(yī)科大學(xué)研究生院（王真，高希武，孫克寧）；寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院骨三科（高希武，金群華）

金群華，E-mail：jinqunhua@sina.com