異種半月板移植實驗研究的初步報告

黃華揚 王澤錦 李憑躍 鄭小飛 王慶 沈洪園

基礎(chǔ)研究

異種半月板移植實驗研究的初步報告

黃華揚 王澤錦 李憑躍 鄭小飛 王慶 沈洪園

目的觀察生物型異種半月板移植修復(fù)羊半月板缺失的效果，探討生物型半月板重建正常膝關(guān)節(jié)半月板的可行性。方法以豬膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)半月板為供體，應(yīng)用環(huán)氧固定技術(shù)對豬半月板進行去抗原處理，制成生物型異種半月板移植體。隨機切除6只山羊一側(cè)膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)半月板，將生物型異種半月板塑形并與羊內(nèi)側(cè)半月板的形態(tài)和尺寸相匹配，原位植入半月板缺失部位。分別于術(shù)后12周、24周、36周處死動物，對移植半月板、股骨內(nèi)側(cè)髁及內(nèi)側(cè)脛骨平臺進行大體形態(tài)、病理切片和電鏡掃描觀察。結(jié)果隨著時間延長，異種移植半月板與周邊組織愈合良好，并逐漸被新生組織替代；術(shù)后12周，移植膝關(guān)節(jié)軟骨未見退變，24～36周后移植膝關(guān)節(jié)軟骨出現(xiàn)輕度退變，移植半月板出現(xiàn)被吸收和宿主纖維母細胞爬行替代現(xiàn)象。結(jié)論我們初步認定，生物型異種半月板作為羊半月板缺失移植的供體可被宿主細胞逐漸替代，逐步形成新生的自體半月板，且短期內(nèi)對移植膝關(guān)節(jié)軟骨具有明顯的保護作用；在實驗各階段均未出現(xiàn)明確的免疫排斥反應(yīng)。

半月板，脛骨；移植，異種；軟骨，關(guān)節(jié)；山羊

膝關(guān)節(jié)半月板損傷是最常見的運動性損傷之一。隨著對半月板的深入認識，其在完成膝關(guān)節(jié)復(fù)雜生物力學(xué)功能中的重要作用已毋庸置疑。對于毀損性半月板損傷，目前多采用同種異體半月板移植進行修復(fù)，療效確切，預(yù)后良好[1-3]，但在臨床應(yīng)用中具有傳播疾病的風(fēng)險，存在受體選擇、倫理學(xué)等問題。異種半月板取材容易，來源廣泛，塑形方便且易保存，可以有效地解決同種異體半月板移植供體來源不足、難以匹配等問題，但相關(guān)報道十分有限[4-7]。本研究旨在通過觀察生物型異種半月板（以豬半月板為供體）修復(fù)羊半月板損傷的效果，以期為異種半月板移植方法的可行性提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6～12月齡山羊共6只，雌雄不限，體重15～30 kg，由解放軍一五七醫(yī)院動物實驗中心提供。

1.2 豬半月板移植體的制備

取豬半月板，以環(huán)氧化物作為交聯(lián)劑，加上多重蛋白修飾技術(shù)，制備成去抗原生物型異種半月板，并進行滅菌照射處理。

1.3 異種半月板移植手術(shù)

隨機選取山羊一側(cè)膝關(guān)節(jié)，暴露并切斷內(nèi)側(cè)副韌帶在股骨的止點，將內(nèi)側(cè)半月板從關(guān)節(jié)囊附著處切除，保留羊半月板前、后角韌帶及半月板脛骨韌帶，修剪生物型半月板至合適大小（圖1），用絲線將移植半月板前、后角韌帶與羊半月板韌帶縫合，然后采用U形縟式縫合將半月板體部與半月板脛骨韌帶相固。術(shù)后關(guān)節(jié)不制動，放養(yǎng)。常規(guī)使用氯霉素、青霉素預(yù)防感染。將6只動物隨機分成3組，每組2只，分別于術(shù)后12周、24周、36周用氯化鉀靜脈注射處死動物，分別取植入膝和對側(cè)膝的半月板和關(guān)節(jié)軟骨備用。

1.4 觀察和檢測指標

術(shù)后觀察山羊步態(tài)、手術(shù)肢體活動及傷口愈合情況。取材后，觀察移植半月板與周圍組織的愈合情況及其在膝關(guān)節(jié)內(nèi)的大體改變，觀察半月板的色澤、有無破損及被吸收情況以及股骨內(nèi)側(cè)髁和內(nèi)側(cè)脛骨平臺關(guān)節(jié)軟骨的變化。半月板植入12周、24周、36周后，將植入半月板和關(guān)節(jié)軟骨分別取材，標本經(jīng)固定、脫鈣處理后按常規(guī)石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片，蘇木精—伊紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)。取部分移植膝半月板、股骨內(nèi)側(cè)髁及內(nèi)側(cè)脛骨平臺軟骨，0.2 mol/L 3%戊二醛固定2 h，經(jīng)PBS緩沖液清洗、餓酸固定、系列脫水、乙酸異戊酯置換、臨界點干燥后，樣品表面鍍金，冷場掃描電鏡(JSM6330F-JEOL)觀察生物型半月板及關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。所有觀察均將同一山羊?qū)?cè)膝內(nèi)側(cè)半月板及軟骨作為對照。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察

2.1.1 動物一般情況 移植術(shù)后6只動物患肢切口均愈合良好，無感染，無死亡。動物手術(shù)后1周內(nèi)活動明顯減少，輕度跛行；1周后活動逐漸好轉(zhuǎn)，動物患肢站立時可觸地，跛行逐漸減輕，3周后基本恢復(fù)正常，未見明顯的患膝活動受限。

2.1.2 移植半月板及移植膝關(guān)節(jié)軟骨情況 術(shù)后12周，植入半月板位置良好，形態(tài)正常，顏色無改變，關(guān)節(jié)內(nèi)有輕度滑膜增生，半月板前后角韌帶結(jié)合部均愈合良好,體部為不完全愈合，但體部與脛骨平臺及半月板脛骨韌帶接觸面連接緊密；未見內(nèi)側(cè)脛骨平臺及股骨內(nèi)側(cè)髁負重面軟骨損傷。術(shù)后24周，植入半月板位置良好，形態(tài)正常，無破損及變形，半月板負重面稍粗糙，顏色未見明顯改變，半月板前后角均愈合良好，體部外緣少量組織連接，與脛骨平臺、關(guān)節(jié)囊結(jié)合部結(jié)合緊密；可見無半月板覆蓋的內(nèi)側(cè)脛骨平臺及股骨內(nèi)側(cè)髁負重面表面軟骨稍粗糙。術(shù)后36周，植入半月板位置良好，形態(tài)正常，顏色略發(fā)黃，半月板前角、體部絲線縫合處見半月板組織被吸收后出現(xiàn)凹陷，范圍約2 mm×1 mm大小，滑膜增生覆蓋凹陷處（圖2A），半月板游離緣未見明顯吸收，前后角及體部均愈合良好，與關(guān)節(jié)囊結(jié)合緊密；本組半月板的整個內(nèi)側(cè)脛骨平臺及股骨內(nèi)側(cè)髁負重面表面粗糙，觸及有磨砂感（圖2B），透明軟骨顏色變淡變薄。實驗動物均未見潰瘍性軟骨損傷、軟骨深部損傷及關(guān)節(jié)邊緣骨贅形成。

圖1 修剪異種半月板至合適大小，保留部分豬半月板前、后角韌帶 圖2異體半月板移植術(shù)后大體觀察 2A 術(shù)后36周，植入半月板前角、體部絲線縫合處見部分半月板組織被吸收后出現(xiàn)凹陷 2B 術(shù)后36周，移植膝股骨內(nèi)側(cè)髁負重面表面粗糙，失去光澤

2.2 組織學(xué)觀察

術(shù)后12周，植入半月板前角周圍自體組織無急性炎癥反應(yīng)；自體新生的纖維結(jié)締組織分布于植入體周圍，局部見肉芽組織增生，長入并包繞植入體，有細胞區(qū)域范圍小、深度淺（圖3A）；移植膝股骨內(nèi)側(cè)髁及內(nèi)側(cè)脛骨平臺未見纖維母細胞明顯增生，間質(zhì)未見炎細胞浸潤。術(shù)后24周，可見植入半月板組織結(jié)構(gòu)保存，未出現(xiàn)急性排斥反應(yīng)；自體組織見肉芽組織形成，長入植入體的新生血管較12周時增多，并由半月板結(jié)合部至游離緣蔓延，肉芽組織包繞、分割植入體伴纖維化，有細胞區(qū)域擴展迅速（圖3B）；移植膝股骨內(nèi)側(cè)髁及內(nèi)側(cè)脛骨平臺透明軟骨細胞輕度增生，表面可見增生的纖維母細胞，間質(zhì)未見炎細胞浸潤。術(shù)后36周，植入半月板組織結(jié)構(gòu)仍未見明顯破壞；肉芽組織間質(zhì)內(nèi)淋巴細胞、漿細胞較前增多，新生的毛細血管長入植入體內(nèi)的范圍、深度均較24周增大、加深，并于植入體邊緣發(fā)現(xiàn)疑似自體纖維軟骨細胞，有細胞區(qū)域已達到植入體的1/2（圖3C，3D）；移植膝股骨內(nèi)側(cè)髁及內(nèi)側(cè)脛骨平臺透明軟骨細胞明顯增生，輕度變性（圖3E）。各組股骨內(nèi)側(cè)髁及內(nèi)側(cè)脛骨平臺未見壞死及纖維化，其下骨小梁未見異常。實驗各階段對側(cè)正常膝半月板及關(guān)節(jié)軟骨均未見明顯退變。

2.3 掃描電鏡觀察

正常山羊半月板表面平整光滑，可見大量平行或交叉排列的膠原纖維束，不同部位其膠原纖維排列方式不同。去抗原異種半月板表面呈波浪狀，與山羊半月板類同；體部纖維束走行與半月板邊緣一致，中間呈交叉走行，前后角呈放射狀走行。術(shù)后36周，異種半月板內(nèi)部各方向膠原纖維的排列仍維持，未見紊亂及明顯吸收現(xiàn)象，但半月板表面光滑度逐漸改變（圖4），且隨著時間延長，其改變更加明顯。

圖3 移植半月板術(shù)后組織學(xué)觀察 3A 術(shù)后12周，肉芽組織增生，長入并包繞植入體，有細胞區(qū)域范圍小深度淺（×40）3B 術(shù)后24周，肉芽組織包繞、分割植入體伴纖維化，有細胞區(qū)域擴展迅速（×40）3C 術(shù)后36周，肉芽組織間質(zhì)內(nèi)淋巴細胞、漿細胞較前增多，有細胞區(qū)域替代已達到植入體的1/2（×40）3D 術(shù)后36周，于植入體邊緣發(fā)現(xiàn)疑似自體纖維軟骨細胞（×400）3E術(shù)后36周，移植膝股骨內(nèi)側(cè)髁透明軟骨細胞明顯增生，輕度變性（×40）（蘇木精—伊紅染色）圖4移植半月板術(shù)后電鏡觀察 4A術(shù)后12周，半月板表面光滑，未見明顯毛糙（×1 000）4B 術(shù)后24周，半月板表面突起漸增加（×1 000）4C 術(shù)后36周，植入半月板內(nèi)部各方向膠原纖維的排列仍維持，未見紊亂及明顯吸收現(xiàn)象（×6 000）4D 術(shù)后36周，植入半月板表面光滑度發(fā)生改變（×500）

3 討論

對于半月板損傷的治療，目前認為應(yīng)以保留或恢復(fù)半月板功能為原則。半月板移植可以最大限度地保留、恢復(fù)半月板功能和膝關(guān)節(jié)穩(wěn)定性，從而延遲膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[8-9]。膝半月板移植技術(shù)通常分為同種異體半月板移植和異種異體半月板移植。同種異體半月板移植后在關(guān)節(jié)內(nèi)的轉(zhuǎn)歸是一個移植半月板組織壞死并由自身組織長入的過程[10]，作為支架，同種異體半月板更接近于自身半月板基質(zhì)，且與關(guān)節(jié)內(nèi)脛骨平臺及股骨髁高度匹配，但同種異體移植存在供體來源有限，大小、形態(tài)匹配有一定難度等問題，因而阻礙了其進一步地推廣和普及。異種異體移植供體來源充足、取材方便、具有天然的力學(xué)特性及生物活性。國外有學(xué)者[11-12]嘗試采用豬小腸黏膜下層組織進行犬半月板移植修復(fù)，結(jié)果顯示異種組織可促進犬大面積缺損半月板的再生，延緩關(guān)節(jié)軟骨的退變過程，從而有利于半月板功能的恢復(fù)。國內(nèi)余家闊等[4]報道了異種異體和同種異體半月板移植修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)半月板缺失的預(yù)后研究，結(jié)果表明，異種異體半月板移植后短期內(nèi)半月板的關(guān)節(jié)軟骨情況良好，但24周后移植物部分被吸收，關(guān)節(jié)軟骨出現(xiàn)退變和損傷；之后謝興等[5]的研究發(fā)現(xiàn)，盡管異種異體半月板移植修復(fù)兔半月板損傷術(shù)后24周移植半月板被破壞，關(guān)節(jié)軟骨出現(xiàn)退變，但與同期的半月板切除膝相比，關(guān)節(jié)軟骨退變較輕，由此推測異種異體半月板移植對關(guān)節(jié)軟骨具有保護作用。

本實驗的前期工作[6]對豬半月板進行了解剖形態(tài)學(xué)研究，結(jié)果證實其可以通過組織修整達到異種半月板移植的厚度匹配，從而為大型動物異種半月板移植提供了現(xiàn)實的可能性。本實驗以山羊作為實驗動物，選用了與人類膠原基因具有高度同源性的豬半月板作為移植材料，將其塑形并與羊半月板相匹配，試圖通過移植后的修復(fù)效果來探討大型動物異種半月板移植的可行性。

針對異種異體移植物的抗原性問題，有研究證實，去抗原豬半月板具有良好的生物支架作用，體外生物相容性良好，不易被生物酶降解[13-15]，因此本實驗利用已取得專利的去抗原處理技術(shù)（以環(huán)氧化物作為交聯(lián)劑，加上多重蛋白修飾去抗原技術(shù)）制備了去抗原生物型異種半月板，不但徹底去除了異種蛋白的免疫原性，而且保留了組織的天然機械性能，沒有毒性殘留物，從而降低了異種異體移植材料的免疫排斥反應(yīng)。

本實驗中異種半月板在各個階段均能保持位置良好，未出現(xiàn)脫出或偏移，我們在半月板移植手術(shù)中采用了保留部分韌帶的固定方法，使縫合更加牢固，更利于組織生長和愈合。隨著時間的延長，植入的異種半月板與關(guān)節(jié)囊及周圍軟組織愈合良好；術(shù)后12周、24周后未見明顯半月板吸收及破損；術(shù)后12周、24周、36周各組組織切片均見肉芽組織長入并逐漸纖維化，宿主細胞逐漸替代供體組織，未見明顯排異反應(yīng)；36周時移植體仍維持原有組織結(jié)構(gòu)。由此可見植入異種半月板可在羊膝關(guān)節(jié)內(nèi)存活，并隨著植入時間的延長，逐漸被自體組織所替代。實驗結(jié)果還顯示，術(shù)后36周于植入體邊緣發(fā)現(xiàn)疑似自體纖維軟骨細胞，細胞胞漿類似軟骨陷窩，但其胞漿呈嗜酸性，胞核大，較深染，又與纖維軟骨細胞有所不同，我們認為此類細胞的出現(xiàn)可能與自體細胞在長入植入體內(nèi)、逐漸替代異種組織的同時具有向纖維軟骨細胞轉(zhuǎn)化的趨勢有關(guān)。此外，術(shù)后36周時植入半月板體部絲線縫合處可見半月板組織被吸收后出現(xiàn)凹陷，范圍較小，組織切片見肉芽組織間質(zhì)內(nèi)淋巴細胞、漿細胞較前增多。分析原因可能包括以下兩點：（1）塑形后異種半月板移植體盡管在形態(tài)、尺寸上與羊半月板相差無幾，但由于成年豬半月板較山羊大且厚，塑形時為避免損傷移植體表面光滑度而放棄改變其厚度，因此其在前后角、游離緣及厚度等方面與受體半月板存在一定的差異，使其與受體關(guān)節(jié)在結(jié)構(gòu)上不能完全匹配；（2）絲線縫合部位刺激引起淋巴細胞、漿細胞聚集，從而導(dǎo)致異種移植體被吸收。幼豬半月板的大小、厚度與成年羊相當，不須塑形即可大大提高關(guān)節(jié)內(nèi)匹配度，且不必損傷植入半月板表面光滑度，故我們認為幼豬半月板應(yīng)為更適用于羊半月板移植的生物材料。

臨床研究表明，半月板部分切除或全切除會加速膝關(guān)節(jié)軟骨退變[16，17]。從本實驗的觀察結(jié)果來看，術(shù)后12周，組織切片未見透明軟骨細胞及纖維母細胞明顯增生，骨小梁未見異常，未見明顯軟骨退變及軟骨下骨壞死。盡管此時移植半月板大部分沒有活細胞，但對受體膝關(guān)節(jié)起到了支撐及穩(wěn)定的作用，使膝關(guān)節(jié)不會由于過早地丟失關(guān)節(jié)間隙而導(dǎo)致骨性關(guān)節(jié)炎的提前發(fā)生，由此推測異種半月板在保護受體膝關(guān)節(jié)軟骨、延緩軟骨退變中起到重要作用。術(shù)后24周，無半月板覆蓋的內(nèi)側(cè)脛骨平臺及股骨內(nèi)側(cè)髁負重面表面軟骨稍粗糙，此時的關(guān)節(jié)軟骨退變可能是由于異種半月板游離緣與羊半月板游離緣之間存在差異而使得移植半月板對羊脛骨平臺的覆蓋面不同所致。術(shù)后36周，軟骨表面粗糙，輕度變性，半月板出現(xiàn)被吸收現(xiàn)象，說明半月板損傷與軟骨退變存在相關(guān)性。術(shù)后24周、36周，移植膝內(nèi)側(cè)脛骨平臺和股骨內(nèi)側(cè)髁軟骨的退變較對側(cè)膝明顯，此時移植的異種半月板體部表面光滑度被破壞，部分組織被吸收，移植體與關(guān)節(jié)的匹配度受到影響，關(guān)節(jié)退變開始加速，因此，異種異體移植對于實驗動物半月板損傷的近期修復(fù)效果如何維持，對關(guān)節(jié)軟骨的保護作用能否持續(xù)，其長期影響有待進一步的深入探討。

綜上所述，我們對異種半月板移植的初步實驗研究得出以下結(jié)論：生物型豬半月板移植體在半月板切除的羊膝關(guān)節(jié)內(nèi)可以存活，并逐漸被自體組織所替代，自體細胞有向纖維軟骨細胞轉(zhuǎn)化的趨勢；異種半月板對移植膝關(guān)節(jié)軟骨具有延緩軟骨退變的作用，且未見明顯的免疫排斥反應(yīng)。本實驗證實了異種半月板移植的短期效果，為拓寬半月板移植來源提供了實驗依據(jù)，但仍存在不足之處，如樣本量少、未設(shè)立同種異體對照組、缺乏去抗原生物型異種半月板的生物力學(xué)研究數(shù)據(jù)、移植的遠期效果有待觀察等等。這些將在今后的實驗中進一步完善。

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（本文編輯 白朝暉）

Xenogenic meniscus transplantation:preliminary report of an experimental study

HUANG Hua-yang,WANG Ze-jin,LI Ping-yue,ZHENG Xiao-fei,WANG Qing,SHEN Hong-yuan.Department of bone and joint diseases,Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Command,Guangzhou 510010,China

Objective To observe the effects of xenogenic meniscus transplantation for repair of goat meniscal defects.Methods Xenogenic meniscus grafts were harvested from medial meniscus of pigs'knee joint.This was accomplished through the use of epoxy fixation technique and molding of the donor menisci to the same shape and size as the host.These menisci were then transplanted into goat hosts.In total six goats were utilized.After transplantation,goats were sacrificed at 12,24,and 36 weeks to observe the implanted menisci and the articular cartilage on medial femoral condylus and medial tibial plateau with the use of gross inspection,histological study and SEM.Results After xenotransplantation,the grafts were well accepted and tolerated.The graft articular cartilage appeared normal at 12 weeks after transplantation.However,at 24～36 weeks,the articular cartilage showed signs of degeneration with the meniscus appeared to have been absorbed,and host fibroblast infiltration. Conclusions It is preliminarily considered that xenogenic meniscus transplants are gradually replaced by host cells,thus transforming them into menisci which are virtually indistinguishable from the host'own,furthermore, the transplantation can protect joint articular cartilage obviously in short term;definite immunological rejection was not discovered during each period.

Menisci,tibial;Transplantation,heterologous;Cartilage,articular;Goats

R617,R687.4

A

1674-666X(2009)02-0117-05

10.3969/j.issn.1674-666X.2009.02.010

廣東省科技計劃項目（2007B031000003）

510010廣州，廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院骨病關(guān)節(jié)科

E-mail：jionhzy@sina.com