復(fù)合振動(dòng)對(duì)去勢(shì)大鼠腓腸肌肌纖維的影響

陳建庭 鄧軒賡 查丁勝 鐘招明

基礎(chǔ)研究

復(fù)合振動(dòng)對(duì)去勢(shì)大鼠腓腸肌肌纖維的影響

陳建庭 鄧軒賡 查丁勝 鐘招明

目的觀(guān)察低強(qiáng)度復(fù)合振動(dòng)對(duì)去勢(shì)SD雌性大鼠腓腸肌肌纖維的影響。方法48只4月齡SD雌性未育大鼠隨機(jī)平分為假手術(shù)對(duì)照組、去勢(shì)對(duì)照組以及4種不同振動(dòng)參數(shù)去勢(shì)振動(dòng)組（去勢(shì)振動(dòng)Ⅰ組：35～45 Hz，0.05～0.1 g；去勢(shì)振動(dòng)Ⅱ組：35～45 Hz，0.12～0.21 g；去勢(shì)振動(dòng)Ⅲ組：45～55 Hz，0.05～0.1 g；去勢(shì)振動(dòng)Ⅳ組：45～55 Hz，0.12～0.21 g），各組置于振動(dòng)臺(tái)上的時(shí)間均相同，僅對(duì)振動(dòng)組施加相應(yīng)參數(shù)的振動(dòng)干預(yù)，實(shí)驗(yàn)時(shí)間13周。比較各組大鼠腓腸肌肌纖維比例及橫截面積。結(jié)果大鼠卵巢切除后腓腸肌纖維比例改變，橫截面積減小，4種參數(shù)的復(fù)合振動(dòng)均可在一定程度上抑制此改變，其中振動(dòng)Ⅳ組抑制腓腸肌纖維比例改變及橫截面積減小的效應(yīng)最明顯。結(jié)論頻率45～55 Hz、強(qiáng)度0.12～0.21 g的復(fù)合振動(dòng)有助于抑制去勢(shì)SD大鼠腓腸肌的肌萎縮改變。

卵巢切除術(shù)；骨質(zhì)疏松；肌，骨骼；肌纖維；振動(dòng)；大鼠

既往研究表明[1]，對(duì)低骨密度的年輕女性施加短時(shí)高頻低強(qiáng)度為期1年的全身振動(dòng)之后，其骨骼和肌肉質(zhì)量均有明顯增加。我們的前期實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)[2]，頻率為35～45 Hz、45～55 Hz，強(qiáng)度為0.05～0.1 g、0.12～0.21 g的短時(shí)復(fù)合振動(dòng)有助于改善去勢(shì)大鼠的骨質(zhì)量，但對(duì)骨骼肌的影響尚不十分清楚。本實(shí)驗(yàn)觀(guān)察了低強(qiáng)度復(fù)合振動(dòng)對(duì)去勢(shì)大鼠腓腸肌肌纖維的影響，以探討其對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠腓腸肌肌纖維變化的預(yù)防作用。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

自制復(fù)合振動(dòng)儀（專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)：CN 101224159），CM1850冰凍切片機(jī)（LEICA），三羥基胺基甲烷（B.M America），無(wú)水硫酸銅（分析純，廣州化學(xué)試劑廠(chǎng)），ATP二鈉（分析純，Amresco），硝酸鉛（分析純，廣州化學(xué)試劑廠(chǎng)），硝酸銀（分析純，廣州化學(xué)試劑廠(chǎng)），氫氧化鈉（化學(xué)純，廣州化學(xué)試劑廠(chǎng)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

4月齡雌性未育SD大鼠48只，體重224～259 g，平均240 g，由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（SPF級(jí)）。

將48只大鼠隨機(jī)分為12籠，每籠4只，按順序編號(hào)，適應(yīng)性飼養(yǎng)4周后，2籠為1組，隨機(jī)平分為假手術(shù)對(duì)照（sham-operation control,SC）組、去勢(shì)對(duì)照（ovariectomized control,OC）組、去勢(shì)振動(dòng)（ovariectomized vibration,OV）Ⅰ組、OVⅡ組、OVⅢ組及OVⅣ組，每組大鼠均為8只。

1.3 實(shí)驗(yàn)干預(yù)方法

雙側(cè)卵巢切除法造模，SC組大鼠僅切除雙側(cè)卵巢周?chē)荆琌C組及4個(gè)OV組大鼠均切除雙側(cè)卵巢。術(shù)后1周切口愈合后，4個(gè)OV組均置于振動(dòng)臺(tái)上，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)振動(dòng)參數(shù)（OV I組：35～45 Hz、0.05～0.1 g；OVⅡ組：35～45 Hz、0.12～0.21 g；OVⅢ組：45～55 Hz、0.05～0.1 g；OVⅣ組：45～55 Hz、0.12～0.21 g）接受振動(dòng)，每組每次振動(dòng)20 min，每天1次，1周5次，休息間隔不超過(guò)2 d，實(shí)驗(yàn)時(shí)間13周。SC組及OC組亦置于振動(dòng)臺(tái)相同的時(shí)間，但不予振動(dòng)。

1.4 腓腸肌切片ATP酶染色

每組隨機(jī)選取6只大鼠進(jìn)行腓腸肌標(biāo)本切片。從凍存管中取出腓腸肌標(biāo)本，迅速以鋒利刀片縱橫各切一刀分別獲得腓腸肌橫截面和縱切面。OTC包埋，冰凍切片機(jī)－25℃、5 μm超薄切片，硅化玻片貼片晾干。試劑配制與染色參照文獻(xiàn)[3]完成。

1.5 切片圖像處理

切片置顯微鏡下觀(guān)察并拍照，采用Image-pro Plus 5.0圖像分析系統(tǒng)對(duì)照片圖像進(jìn)行定量和定性分析。根據(jù)ATP酶染色深淺不同將肌纖維分為I型、IIa型和IIb型（由2名病理科實(shí)驗(yàn)人員共同確認(rèn)），并按不同類(lèi)型肌纖維分別計(jì)數(shù)，計(jì)算百分比并測(cè)量各型肌纖維橫截面積（cross section area, CSA，圖1）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包，各測(cè)得值以x-±s表示，統(tǒng)計(jì)方法采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用SNK-q法，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

各組大鼠無(wú)死亡脫落，振動(dòng)組大鼠經(jīng)3～4 d適應(yīng)振動(dòng)后，于振動(dòng)臺(tái)上活動(dòng)無(wú)異常。

2.1 各組大鼠腓腸?、裥?、Ⅱ型肌纖維比例的比較

圖1 各組大鼠腓腸肌肌纖維橫截面（ATP酶染色 ×10）以O(shè)VⅡ組為例，染色最淺的為I型纖維，染色最深的為Ⅱa型纖維，兩者之間的為IIb型纖維。比較SC組與OC組，可以直觀(guān)地看出卵巢切除后大鼠腓腸肌肌纖維CSA減小

各組大鼠腓腸肌肌纖維比例（ATP酶染色）比較結(jié)果見(jiàn)表1。切除卵巢后，與SC相比，OC組大鼠Ⅰ型纖維比例下降，Ⅱa型、Ⅱb型纖維比例上升。不同的復(fù)合振動(dòng)干預(yù)后，與OC組相比，OVⅢ、OVⅣ組能有效改善I型纖維比例，復(fù)合振動(dòng)對(duì)去勢(shì)各組Ⅱ型纖維比例改善無(wú)顯著作用。但OVⅣ組能有效維持Ⅱb型肌纖維比例。

2.2 各組腓腸肌Ⅰ型、Ⅱ型肌纖維CSA的比較

各組腓腸肌Ⅰ型、Ⅱ型肌纖維CSA的比較結(jié)果見(jiàn)表2。卵巢切除后，與SC組相比，OC組大鼠Ⅰ型、Ⅱb型肌纖維CSA顯著下降。復(fù)合振動(dòng)干預(yù)后，與OC組相較，所有卵巢切除振動(dòng)組均顯著提高腓腸?、裥屠w維CSA，OVⅡ、OVⅢ、OVⅣ組可顯著提高IIb型纖維CSA。

3 討論

預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松性骨折的一個(gè)重要方面是降低非暴力跌倒概率，其主要途徑是增加肌力，改善機(jī)體平衡能力。通常情況下，骨的最大應(yīng)力來(lái)源于肌肉收縮[4]，肌力在調(diào)節(jié)骨的形態(tài)、尺寸、強(qiáng)度等方面具有重要作用，是影響骨形成的重要因素之一[5-7]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明雌激素缺失可導(dǎo)致大鼠骨骼肌萎縮[8-10]，并影響萎縮骨骼肌的質(zhì)量恢復(fù)[10]。

骨骼肌肌纖維型的構(gòu)成和分布是闡明骨骼肌功能的重要依據(jù)之一。研究表明，人和動(dòng)物單個(gè)骨骼肌纖維的酶活性存在極大差異，酶組織化學(xué)研究證實(shí)人類(lèi)骨骼肌至少含有2種類(lèi)型的肌纖維，即Ⅰ型纖維和Ⅱ型纖維[11]。Ⅰ型纖維含有高濃度的氧化酶類(lèi)如琥珀酸脫氫酶，涉及有氧代謝；Ⅱ型纖維含有高濃度的糖酵解酶如磷酸化酶，主要涉及無(wú)氧代謝。不同類(lèi)型肌纖維ATP酶的含量不同，在功能上也存在一定差別，因而通過(guò)酶組織化學(xué)染色可以將不同類(lèi)型的肌纖維得以區(qū)分。肌球蛋白ATP酶染色是目前確定骨骼肌肌纖維型的方法之一[3]，不需要專(zhuān)用抗體，肌纖維染色結(jié)果清晰直觀(guān)，因而一直被研究者采用。

表1 各組大鼠腓腸肌Ⅰ型、Ⅱ型肌纖維比例的比較結(jié)果（%,n=6,x-±s）

表2 各組大鼠腓腸肌I型、II型肌纖維CSA的比較結(jié)果（μm2,n=6,x-±s）

我們的前期工作證實(shí)，一定的復(fù)合振動(dòng)可以增加去勢(shì)大鼠的腰椎骨密度，具有潛在的預(yù)防骨質(zhì)疏松的作用[12]。在本組實(shí)驗(yàn)中，較之SC組，OC組大鼠腓腸肌出現(xiàn)顯著變化，I型纖維比例降低而II型纖維比例升高，CSA下降。這說(shuō)明骨質(zhì)疏松大鼠在骨質(zhì)量降低的同時(shí)，腓腸肌也隨之相應(yīng)改變。盡管這種改變對(duì)大鼠肌肉功能的影響尚不明確，但至少存在潛在的不利影響。

本組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，所有OV組大鼠的腓腸肌I型肌纖維CSA均可在一定程度上得以維持，且除OVⅠ組外的其余OV組均未見(jiàn)IIb型肌纖維CSA有明顯降低。Falempin等[13]的研究表明，低強(qiáng)度高頻率的振動(dòng)訓(xùn)練有助于降低肌肉丟失的程度以及肌纖維CSA減少的幅度。我們的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，一定強(qiáng)度和頻率的復(fù)合振動(dòng)可抑制因卵巢切除所導(dǎo)致的肌萎縮，這可能有利于卵巢切除大鼠肌力的維持。在所有OV組中，OVⅣ組體重顯著高于OC組，且OVⅣ組肌重比最高，I型和IIb型肌纖維CSA最大，因此我們推測(cè)OVⅣ組體重的顯著增加可能也是最大程度抑制肌萎縮的結(jié)果之一。

肌肉功能的實(shí)現(xiàn)有賴(lài)于其特定肌纖維的正常比例。與復(fù)合振動(dòng)抑制肌萎縮作用普遍有效不同的是，本組實(shí)驗(yàn)中僅OVⅢ、OVⅣ組I型纖維的比例明顯增高，II型纖維出現(xiàn)了比例逐漸升高的趨勢(shì)，提示復(fù)合振動(dòng)對(duì)抑制卵巢切除大鼠肌纖維比例改變的作用相對(duì)有限，延長(zhǎng)振動(dòng)干預(yù)時(shí)間是否會(huì)有更好的結(jié)果尚有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。未能動(dòng)態(tài)觀(guān)察復(fù)合振動(dòng)對(duì)卵巢切除大鼠腓腸肌肌纖維改變的作用是本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上的一個(gè)遺憾，使本研究的外推性受到一定限制。

Edstrom等[14]的研究顯示大鼠肌肉體積減少與肌力下降密切相關(guān)。而肌纖維直徑變化是對(duì)肌負(fù)荷的適應(yīng)性反應(yīng)，負(fù)荷刺激后肌纖維肥大性改變也是運(yùn)動(dòng)能力提高的標(biāo)志之一[15]。我們的實(shí)驗(yàn)表明復(fù)合振動(dòng)可以有效地預(yù)防肌萎縮，具有維持肌肉體積的作用，由此可能有助于大鼠肌力的維持，進(jìn)而提高平衡能力。此外，振動(dòng)對(duì)機(jī)體平衡能力的直接改善也得到了實(shí)驗(yàn)證實(shí)。Ebersbach等[16]報(bào)道，僅4周的振動(dòng)干預(yù)即可使帕金森病患者的身體平衡能力和步態(tài)穩(wěn)定性獲得顯著改善；而Kawanabe等[17]的研究也證實(shí)了全身振動(dòng)對(duì)老年人肌力、平衡能力及步行穩(wěn)定性方面的明顯改善作用，且該方式對(duì)老年人群是安全的，并有較好的耐受性。由此推測(cè)復(fù)合振動(dòng)也可維持或改善機(jī)體的平衡能力。

我們的研究表明，頻率45 Hz～55 Hz、強(qiáng)度0.12 g～0.21 g的復(fù)合振動(dòng)可以有效抑制卵巢切除大鼠腓腸肌萎縮以及肌纖維比例的改變，抑制肌力的衰退，可能具有維持或改善卵巢切除大鼠機(jī)體平衡能力的作用，目前相關(guān)機(jī)制尚不清楚，值得進(jìn)一步研究。

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12鄧軒賡,陳建庭,馮鷹,等.復(fù)合振動(dòng)預(yù)防去勢(shì)大鼠骨質(zhì)疏松的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志,2008,23(4):325-329.

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（本文編輯 白朝暉）

Effect of compound vibration on gastrocnemius muscle fibers in ovariectomized rats

CHEN Jian-ting*,DENG Xuan-geng,ZHA Ding-sheng,ZHONG Zhao-ming.*Department of Orthopaedics and Spine center, Nanfang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou 510515,China

Objective To observe the effect of compound vibration with low intensity on gastrocnemius muscle fibers in ovariectomized rats.Methods Fourty-eight 4-months old SD rats were randomly divided into 6 groups (n=8):sham-operation control group(SC),ovariectomized control group(OC),ovariectomized vibration groupⅠ(OVⅠ,35-45 Hz,0.05-0.1 g),groupⅡ (OVⅡ,35-45 Hz,0.12-0.21 g),groupⅢ (OVⅢ,45-55 Hz, 0.05-0.1 g)and groupⅣ (OVⅣ,45-55 Hz,0.12-0.21 g).The experiment started at 1 week after ovariectomy and the two control groups received no intervention except the noise of machine while the experimental groups were treated with vibration.The entire experiment lasted 13 weeks.The ratio types and cross section area(CSA) of gastrocnemius muscle fibers would be compared among groups by the end of testing.Results Ratio of gastrocnemius muscle fibers types from SD rats changed and CSA decreased after ovariectomy,but these changes could be inhibited by the intervention of compound vibration,especially by the vibration with 45-55 Hz frequency and 0.12-0.21 g magnitude.Conclusion The compound vibration(45-55 Hz,0.12-0.21 g)can help to inhibit the changes of gastrocnemius muscle atrophy in ovariectomized SD rats.

Ovariectomy;Osteoporosis;Muscle,skeletal;Muscle fibers;Vibration;Rats

R681.4,R49,R361.1

A

1674-666X(2009)02-0113-04

10.3969/j.issn.1674-666X.2009.02.009

廣東省自然科學(xué)基金（06024394）

510515廣州，南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院脊柱骨病科（陳建庭、查丁勝、鐘招明）；610041成都，四川省骨科醫(yī)院脊柱骨科（鄧軒賡）

E-mail：chenjt99@vip.sina.com