真核表達(dá)載體pIRES2EGFP-Cadherin-11的構(gòu)建及其在BMSCs內(nèi)的表達(dá)

柳大烈 王競鵬 林立新 王晉煌 陳兵 陳伯華

真核表達(dá)載體pIRES2EGFP-Cadherin-11的構(gòu)建及其在BMSCs內(nèi)的表達(dá)

柳大烈 王競鵬 林立新 王晉煌 陳兵 陳伯華

目的構(gòu)建pIRES2EGFP-Cadherin-11真核表達(dá)載體，并檢測其在BMSCs中的表達(dá)情況。方法應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)從人Cadherin-11 cDNA中擴(kuò)增出Cadherin-11基因后，以內(nèi)切酶Xho I和EcoR I進(jìn)行雙酶切，將其插入用相同酶處理的載體pIRES2EGFP；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs，應(yīng)用Western blot方法檢測其在細(xì)胞中的表達(dá)情況。結(jié)果酶切和測序結(jié)果表明，擴(kuò)增的Cadherin-11基因序列正確，大小為2 390 bp；Western blot表明，Cadherin-11蛋白在BMSCs中正確表達(dá)，大小約88 kD。結(jié)論Cadherin-11蛋白能在BMSCs中高度表達(dá)，可望用于提高BMSCs與支架材料的粘附性。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞種子細(xì)胞組織工程細(xì)胞粘附構(gòu)建

目前，骨缺損的治療多采用生物材料或非生物材料植入的方法進(jìn)行修復(fù)，效果均不完美。組織工程技術(shù)的發(fā)展為骨缺損的修復(fù)提供了新的思路，而其核心是種子細(xì)胞和生物支架材料。理想的種子細(xì)胞應(yīng)具有取材方便，增殖分化能力強(qiáng)的特點。目前，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）是構(gòu)建組織工程骨最有應(yīng)用前景的種子細(xì)胞之一，但其必須與材料發(fā)生適當(dāng)?shù)恼掣?，才能進(jìn)行遷移、增殖和分化，所以黏附是種子細(xì)胞發(fā)揮功能的始動階段。當(dāng)前，該領(lǐng)域的研究多集中于從材料的表面修飾、生化性質(zhì)、空間構(gòu)型等入手，甚少從種子細(xì)胞的基因修飾方面開展。盡管目前國內(nèi)外有較多構(gòu)建組織工程骨的報道，但種子細(xì)胞的成骨定向誘導(dǎo)分化及與支架材料復(fù)合過程中粘附性都有待加強(qiáng)，對提高種子細(xì)胞在修復(fù)過程中的“主導(dǎo)”作用尚沒有好的方法解決。因此對種子細(xì)胞進(jìn)行基因修飾，可以解決構(gòu)筑組織工程骨的關(guān)鍵步驟?；谝陨峡紤]，本研究擬將鈣黏蛋白11（Cadherin-11）基因修飾種子細(xì)胞，使之具有良好黏附特性，并以生物可降解材料作為支架來構(gòu)建組織工程骨。

1 材料和方法

1．1材料

質(zhì)粒Cadherin-11 cDNA和pIRES2EGFP載體由日本神戶Riken分子生物中心Takeichi教授惠贈。大腸桿菌DH5α由本實驗室保存。限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、Taq酶購自TaKaRa公司；DNA純化試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；DMEM培養(yǎng)基、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司；抗Cadherin-11蛋白抗體購自美國英杰生命技術(shù)公司。

1．2方法

1．2．1構(gòu)建真核表達(dá)載體pIRES2EGFP-Cadherin-11

人Cadherin-11的PCR擴(kuò)增：根據(jù)GenBank中報告的序列設(shè)計引物。上游引物為：5′-CCGCTCGAGATGAAG GAGAACTACT GTTTAC-3′；下游引物為：5′-CGGAATTCTTA AGAATCGTCATCAAAATGTCT-3′；上下游引物分別攜帶Xho I和EcoR I酶切位點。PCR引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。PCR模板為人的Cadherin-11 cDNA，PCR反應(yīng)條件為：首先94℃變性1 min，然后以52℃復(fù)性1 min，72℃延伸5 min，進(jìn)行25個循環(huán)。

1．2．2真核表達(dá)載體的酶切鑒定與測序

將純化后的上述PCR產(chǎn)物Cadherin-11經(jīng)Xho I和EcoR I酶切后連接到經(jīng)同樣酶切的pIRES2EGFP載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取轉(zhuǎn)化質(zhì)粒。采用以上兩種內(nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定，得到目的基因大小片段的克隆判定為陽性克隆，然后進(jìn)行測序。

1．2．3真核表達(dá)載體的蛋白表達(dá)鑒定

將測序正確的陽性克隆重新轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒，去除內(nèi)毒素后轉(zhuǎn)染BMSCs，用特異性抗Cadherin-11抗體檢測其表達(dá)蛋白大小。將BMSCs接種于6孔板內(nèi)，待細(xì)胞融合達(dá)到90%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將2孔細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染空載體和重組質(zhì)粒pIRES2EGFP-Cadherin-11各0.5μg。轉(zhuǎn)染前2 h換上0.5 mL新鮮培養(yǎng)基，同時準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染混合液。轉(zhuǎn)染后4 h更換培養(yǎng)基，更換后培養(yǎng)基體積為4 mL。

1．2．4細(xì)胞培養(yǎng)

利用密度梯度離心法分離培養(yǎng)B MSCs，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于培養(yǎng)箱（37°C，5% CO2）中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前24 h將細(xì)胞接種于24孔板，細(xì)胞密度大約為90%。

2 結(jié)果

2.1 Cadherin-11片段的擴(kuò)增和重組質(zhì)粒的鑒定

將從質(zhì)粒Cadherin-11 cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳，可見在2 390 bp附近有一條帶，與預(yù)計的目的片段大小位置相符（圖1A）。pIRES2EGFP-Cadherin-11重組質(zhì)粒分別經(jīng)Xho I和EcoR I雙酶切后產(chǎn)生約2 390 bp大小的目的片段（圖1B）。

圖1 Cadherin-11片段的PCR擴(kuò)增和重組質(zhì)粒的鑒定

2．2重組質(zhì)粒pIRES2EGFP-Cadherin-11的真核表達(dá)鑒定

將重組質(zhì)粒pIRES2EGFP-Cadherin-11轉(zhuǎn)染B MSCs細(xì)胞后進(jìn)行Western blot檢測，在88 kD附近見到條帶，與預(yù)計蛋白大小相同。

3 討論

Cadherin-11是促進(jìn)黏附的重要分子之一。Cadherin-11屬鈣黏附蛋白家族，是一種鈣離子依賴性介導(dǎo)細(xì)胞間黏附的單鏈跨膜糖蛋白，主要通過其胞外結(jié)構(gòu)域發(fā)揮黏附作用，激活PKC等信號通路，與連環(huán)蛋白相連，引起細(xì)胞骨架蛋白構(gòu)象改變，最終發(fā)揮其生物活性[1]。另外，它與胚胎肢節(jié)形成、骨組織和神經(jīng)元等的形成、腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移等關(guān)系密切[2－3]。Cheng等[4]認(rèn)為BMP-2的促成骨效應(yīng)即借助于Cadherin-11的功能。鈣黏附蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞黏附通過增強(qiáng)細(xì)胞成熟信號，激活堿性磷酸酶、骨鈣素（OCN）等成骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，在成骨細(xì)胞分化的過程中發(fā)揮著重要作用。基因敲除實驗證實，胚胎發(fā)育中Cadherin-11影響著成骨細(xì)胞分化過程中的細(xì)胞排列、聚集及分離。Bourne等[5]用Cadherin-11抗體對胚胎干細(xì)胞進(jìn)行磁珠分選，發(fā)現(xiàn)獲得的細(xì)胞利于細(xì)胞的成骨分化并激活細(xì)胞的重排。這些證據(jù)表明，利用Cadherin-11基因?qū)MSCs進(jìn)行基因修飾，可望促進(jìn)細(xì)胞的黏附性能。

盡管Cadherin-11可以提高黏附特性，但僅是啟動了細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞生物功能的第一步，是否能向特定細(xì)胞表型（成骨細(xì)胞方向）分化尚不確定。目前已有報道利用BMPs、TGF-β、IL-6、LMP-1等可促進(jìn)成骨分化，然而這些方法誘導(dǎo)細(xì)胞分化特異性差，需要劑量大，費用高，最為重要的是不能在種植局部提供持續(xù)的骨誘導(dǎo)信號[6-7]。為適應(yīng)構(gòu)建組織工程骨的要求，有必要尋求一種能高效、特異定向分化的方法。因此，有學(xué)者在支架材料表面加附各種細(xì)胞粘附因子：如膠原、纖黏蛋白（FN）、層黏連蛋白及RGD短肽等。Chuang等[8]證實生物材料用同種細(xì)胞外基質(zhì)包埋后，其吸附細(xì)胞的數(shù)量增加了48%，提示ECM中的這類成分能增加細(xì)胞的黏附力。亦有學(xué)者對材料表面理化性質(zhì)進(jìn)行改造（如等離子處理、機(jī)械牽張等），以提高細(xì)胞的黏附和伸展[9-10]。然而這些方案更多地是從材料的生物相容性考慮，沒有從細(xì)胞這一內(nèi)因著手，故而對提高細(xì)胞黏附的能力有限。我們在利用成骨樣細(xì)胞與膠原包埋的PGA復(fù)合構(gòu)建組織工程骨時發(fā)現(xiàn)，種子細(xì)胞與支架材料黏附存在不確定性。Cutlera等[11]利用種子細(xì)胞表達(dá)Fn增強(qiáng)與整合素結(jié)合，從而促進(jìn)細(xì)胞與材料的黏附。因此，我們嘗試?yán)贸晒翘禺愋遭}黏蛋白（Cadherin-11）對種子細(xì)胞進(jìn)行基因修飾。首先應(yīng)用基因克隆技術(shù)將Cadherin-11基因成功插入真核表達(dá)載體pIRES2EGFP中，PCR結(jié)果顯示獲得了大小正確的Cadherin-11基因片段，酶切和測序結(jié)果表明，pIRES2EGFP-Cadherin-11重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。為了進(jìn)一步驗證該重組質(zhì)粒在BMSCs中是否表達(dá)Cadherin-11蛋白，我們利用轉(zhuǎn)染和免疫印跡的方法進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，在BMSCs細(xì)胞中能夠檢測到Cadherin-11蛋白，大小正確，說明構(gòu)建的重組質(zhì)粒具有表達(dá)能力，為下一步的實驗奠定了基礎(chǔ)。

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本刊協(xié)辦單位名錄

上海威寧整形制品公司 四川西蟬整形美容醫(yī)院

上海迪加科技有限公司 中山市冠鷹醫(yī)療器械制造有限公司

上海索康醫(yī)用材料有限公司 奇致激光技術(shù)（中國）有限公司

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北京科儀真燕山醫(yī)療技術(shù)有限公司 蘭州生物技術(shù)開發(fā)有限公司

Experimental Study on the Construction of pIRES2EGFP-Cadherin-11 Eukaryotic Vector and the Expression of BMSCs

LIU Dalie1,WANG Jingpeng1,LIN Lixin2,WANG Jinhuang1,CHEN Bin1,CHEN Bohua1.
1 Department of Plastic Surgery,Zhujiang Hospital,The South Medical University,Guangzhou 510282,China;2 Department of Plastic and Aesthetic Surgery,Yuhuangding Hospital,Yantai 264000,China.

ObjectiveTo construct pIRES2EGFP-Cadherin-11 eukaryotic vector and detect its expression in BMSCs cells.MethodsCadherin-11 genes were amplified from human cadherin-11(CDH11)cDNA by polymerase chain reaction (PCR)and cloned into pIRES2EGFP.After the recombinant plasmid was transferred into BMSCs,protein expression of the plasmid was examined by Western blot.ResultsDNA sequencing and enzyme digestion showed that the cloned cadherin-11 gene was correct.It was about 2 390 bp.The expression of cadherin-11 protein in BMSCs were 88 kD.ConclusionCadherin-11 is a Ca2+-dependent homophilic cell adhesion molecule that is expressed mainly in osteoblasts.The data suggested that cadherin-11 protein can express in BMSCs and improve the adhesion between BMSCs and scaffolds.

Bone mesenchymal stem cells;Seeding-cells;Tissue engineering;Cell adhesion;Construction

Q781

A

1673－0364（2009）03－0131－03

2009年4月3日；

2009年5月7日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.06.004

國家自然科學(xué)基金（30570517）。

510282廣東省廣州市南方醫(yī)科大學(xué)附屬珠江醫(yī)院整形美容科（柳大烈，王競鵬，王晉煌，陳兵，陳伯華）；264000山東省煙臺市煙臺市毓璜頂醫(yī)院整形美容科（林立新）。