應(yīng)用生物反應(yīng)器構(gòu)建組織工程化血管的實驗研究

許志成 張文杰 李宏 周廣東 崔磊 劉偉 曹誼林

應(yīng)用生物反應(yīng)器構(gòu)建組織工程化血管的實驗研究

許志成 張文杰 李宏 周廣東 崔磊 劉偉 曹誼林

目的探討利用生物反應(yīng)器體外構(gòu)建具有完整結(jié)構(gòu)的組織工程化血管的可行性。方法從6月齡畢格犬頸總動脈獲取平滑肌細胞，頸外靜脈獲取內(nèi)皮細胞，經(jīng)體外培養(yǎng)擴增。然后，先將平滑肌細胞接種于聚羥基乙酸（PGA）上，形成細胞—材料復(fù)合物，將該復(fù)合物置于生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)。模擬成年哺乳動物循環(huán)系統(tǒng)的參數(shù)，予以動態(tài)力學(xué)刺激（搏動頻率：75次/分；擴張量＜5%）。8周后，在其上接種內(nèi)皮細胞，對照組不接種內(nèi)皮細胞，培養(yǎng)5 d后取材檢測。結(jié)果組織學(xué)染色顯示，平滑肌纖維成分排列較規(guī)則，有層次感，內(nèi)皮細胞完整；對照組未見內(nèi)皮細胞層結(jié)構(gòu)。結(jié)論利用生物反應(yīng)器可在體外構(gòu)建具有完整結(jié)構(gòu)的組織工程化血管。

組織工程生物反應(yīng)器血管構(gòu)建

尋求理想的血管移植物是臨床亟待解決的重大課題，組織工程學(xué)為這一難題的解決帶來了希望。血管是在持續(xù)的血流動力學(xué)刺激下形成并生長的特殊組織，而體外靜態(tài)環(huán)境下構(gòu)建的血管組織結(jié)構(gòu)欠佳，缺乏正常的生理功能[1-4]。我們的前期實驗證實，在血管構(gòu)建過程中引入力學(xué)刺激因素是可行的[5]。應(yīng)用能模擬體內(nèi)血液循環(huán)、血管搏動的裝置—生物反應(yīng)器，可以產(chǎn)生具有一定力學(xué)強度的組織工程化血管平滑肌層[6-7]。本實驗在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用生物反應(yīng)器構(gòu)建具有完整內(nèi)皮層與平滑肌層的組織工程化血管。

1 材料與方法

1．1材料

1．1．1實驗動物

畢格犬，6月齡，體重8～10 kg，雌雄不限，上海農(nóng)學(xué)院提供。

1．1．2試劑

胎牛血清（美國Gibco公司），PBS溶液，一抗:鼠抗人α-SM actin（α-smooth muscle actin）（美國DAKO公司）；鼠抗人Ⅷ因子抗體（美國DAKO公司），二抗：EnVisin+TM Peroxidase Mouse（美國DAKO公司），goat anti-mouse lgG-FITC（fluorescein isothiocyanate）（美國Santa Cruz公司）。

1．1．3血管生物反應(yīng)器的構(gòu)造

血管生物反應(yīng)器包括反應(yīng)槽、控制器、壓力傳感器、電磁閥、貯液罐及蠕動泵，經(jīng)連接組裝后可置于培養(yǎng)箱內(nèi)[8]，使用前予以環(huán)氧乙烷熏蒸消毒。

1.1 ．4實驗分組

分實驗組(n=5)與對照組(n=5)。實驗組在生物反應(yīng)器動態(tài)槽內(nèi)予以動態(tài)力學(xué)刺激培養(yǎng)，對照組培養(yǎng)在生物反應(yīng)器靜態(tài)槽內(nèi)。

1．2方法

1．2．1血管平滑肌細胞的分離、培養(yǎng)

無菌切取犬一側(cè)頸總動脈，將動脈中膜剪成1mm×1mm×1mm的組織塊，均勻鋪于培養(yǎng)皿，貼壁后加入含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，細胞生長達匯合后，0.25%胰蛋白酶消化，傳代后繼續(xù)培養(yǎng)，取第2代細胞用于實驗。

1．2．2血管內(nèi)皮細胞的分離、培養(yǎng)

無菌切取一段犬頸外靜脈,PBS沖洗靜脈管腔2～3遍，至沖洗液清亮后，向靜脈管腔內(nèi)灌入0.1%的Ⅰ型膠原酶2 mL，37℃消化15～20 min，收集消化液，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，收集細胞，洗滌后計數(shù)，接種于直徑60 mm的培養(yǎng)皿，加入EGM-2培養(yǎng)液，置于37℃、5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)，次日換液，以后每2～3 d換液1次。

1．2．3形態(tài)學(xué)觀察

倒置相差顯微鏡觀察細胞生長、增殖、基質(zhì)分泌情況和細胞形態(tài)變化。當(dāng)細胞生長達融合時，PBS沖洗，2%戊二醛固定24 h，收集細胞，常規(guī)超薄切片，HITACHI-800型透射電鏡觀察細胞的超微結(jié)構(gòu)。平滑肌細胞-PGA復(fù)合物體外培養(yǎng)4～5 d，留取標(biāo)本，經(jīng)2%戊二醛固定，常規(guī)超薄切片，PHILIPS XL30-ESEM型掃描電鏡觀察細胞與材料復(fù)合物生長情況。

1.2.4 細胞鑒定

進行免疫熒光染色，第2代平滑肌細胞爬片，檢測α-SM actin；第3代內(nèi)皮細胞爬片，檢測Ⅷ因子，以確定細胞來源。

1.2.5 細胞與PGA復(fù)合及生物反應(yīng)器內(nèi)特定參數(shù)下的動態(tài)培養(yǎng)

收集第2代平滑肌細胞，總數(shù)為2×107個，離心，去上清液，加入100μl含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，制成細胞懸液均勻接種于3 cm×2 cm×1 mm的片狀未編織PGA上，置于37℃、5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)，4 h后加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，靜置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，每天更換培養(yǎng)液。1周后，將細胞材料復(fù)合物卷裹于無菌硅膠管外部。實驗組：將其接于動態(tài)槽內(nèi)接口，予以動態(tài)力學(xué)刺激，參數(shù)設(shè)定為：搏動頻率75次/分，擴張量＜5%，壓力為0～0.02 MPa，流量為0～80 mL/min，流量控制電壓為0～5 V（壓力、流量和流量控制電壓在給定的范圍內(nèi)由零開始，每日漸增）；對照組：將其置于生物反應(yīng)器靜態(tài)槽內(nèi)培養(yǎng)。兩組均4～5 d換一次液。8周后收集內(nèi)皮細胞，制成含內(nèi)皮細胞總數(shù)為5×106個的細胞懸液50μL，均勻接種于管腔內(nèi)表面，EGM-2培養(yǎng)液繼續(xù)體外培養(yǎng)，5 d后取材檢測。

1.2.6 檢測

常規(guī)石蠟切片，HE染色顯示血管平滑肌纖維，免疫組織化學(xué)染色檢測血管α-SM actin與Ⅷ因子。

2 結(jié)果

2．1平滑肌細胞培養(yǎng)與鑒定

組織塊貼壁培養(yǎng)后第5～6天，鏡下可見細胞從組織塊周圍爬出，貼壁后伸展變?yōu)殚L梭形，4 d后達融合狀態(tài)[7]。透射電鏡觀察第二代平滑肌細胞漿，見有長條形電子密度集中的細胞器—密斑，是平滑肌細胞特征性超微結(jié)構(gòu)。免疫熒光檢測可見細胞胞漿呈現(xiàn)FITC綠色熒光表達，為α-SM actin陽性，空白對照及陰性對照（軟骨細胞）為陰性。上述結(jié)果說明，體外培養(yǎng)的第2代平滑肌細胞能表達其特征性指標(biāo)。

2．2內(nèi)皮細胞培養(yǎng)與鑒定

原代內(nèi)皮細胞在接種培養(yǎng)皿后，2 h內(nèi)貼壁并伸展，呈集落樣生長（圖1a），2周可達融合。傳代后的細胞呈現(xiàn)典型的鵝卵石樣形態(tài)，7 d達融合狀態(tài)（圖1b）。為鑒定細胞來源，取第3代細胞進行透射電鏡觀察，可見內(nèi)皮細胞漿內(nèi)有多個散在的高電子密度的長桿狀W-P小體（圖1c），是內(nèi)皮細胞特有的超微結(jié)構(gòu)；第3代細胞免疫熒光檢測，熒光顯微鏡下可見內(nèi)皮細胞胞漿呈現(xiàn)FITC綠色熒光，為Ⅷ因子陽性（圖1d），空白對照及陰性對照（軟骨細胞）胞漿未呈現(xiàn)FITC綠色熒光表達，均為陰性。上述結(jié)果說明，體外培養(yǎng)的第3代內(nèi)皮細胞能表達其特征性指標(biāo)，可用于組織工程化血管構(gòu)建。

2．3大體觀察

培養(yǎng)8周后，可見新生的組織工程化血管形成。兩組血管均色澤光亮，質(zhì)地均勻，管腔圓潤，具有一定的彈性（圖2）。

2．4組織學(xué)觀察

2．4．1 HE染色

實驗組可見PGA纖維基本已降解，平滑肌纖維排列規(guī)則，有層次感，分布較均勻，內(nèi)層細胞結(jié)構(gòu)連續(xù)完整；對照組細胞壁結(jié)構(gòu)與實驗組未見明顯差異，但管壁內(nèi)側(cè)未見明顯連續(xù)而完整的細胞層結(jié)構(gòu)。

2．4．2免疫組織化學(xué)染色

兩組血管的血管壁均呈現(xiàn)層狀棕黃色顆粒沉積，為α-SM actin陽性表達。實驗組血管壁內(nèi)側(cè)有連續(xù)棕黃色顆粒沉積，為Ⅷ因子陽性表達；對照組血管壁內(nèi)側(cè)未見明顯Ⅷ因子陽性表達。說明實驗組在管壁內(nèi)側(cè)接種內(nèi)皮細胞后可產(chǎn)生結(jié)構(gòu)完整的組織工程化血管（圖3）。

圖1 內(nèi)皮細胞形態(tài)學(xué)觀察

圖2 組織工程化血管大體觀察

圖3 實驗組與對照組8周時的組織學(xué)檢測（200×）

3 討論

本實驗室前期實驗結(jié)果顯示，在生物反應(yīng)器內(nèi)動態(tài)培養(yǎng)6～8周，可形成具有良好組織學(xué)結(jié)構(gòu)與生物力學(xué)性能的組織工程化血管平滑肌層[6-7]。但是，血管內(nèi)皮細胞是血管內(nèi)膜的主要成分，為扁平鱗狀細胞，隨血流呈單層縱向排列，細胞長軸與血流方向平行。內(nèi)皮細胞對維持血流的穩(wěn)定，維護血管壁的完整，穩(wěn)定物質(zhì)交換平衡，參與凝血與抗凝血活動，分泌血管舒縮物質(zhì)，攝取、轉(zhuǎn)換或滅活血循環(huán)與局部產(chǎn)生的活性物質(zhì)，調(diào)節(jié)平滑肌細胞生長等方面都起了至關(guān)重要的作用。因此，血管內(nèi)皮層的構(gòu)建也是至關(guān)重要的。

本實驗結(jié)果顯示，在生物反應(yīng)器內(nèi)動態(tài)環(huán)境下培養(yǎng)的組織工程化血管平滑肌層在復(fù)合內(nèi)皮細胞后產(chǎn)生的組織工程化血管，組織學(xué)結(jié)構(gòu)層次清晰，平滑肌層排列規(guī)則整齊，內(nèi)皮細胞層完整。說明適宜的力學(xué)刺激有利于血管組織形成及細胞適應(yīng)性再塑，促進內(nèi)皮細胞分泌各種血管活性因子，并可間接增加纖溶酶的活性，從而減少內(nèi)皮細胞脫落。適宜的力學(xué)刺激可以促進平滑肌細胞生長、增殖與分化，促進細胞定向排布，增加膠原含量，從而增加平滑肌細胞收縮特性。

本實驗中的生物反應(yīng)器，主要模擬了血管承受的雙軸張力，即細胞橫斷面上的同向張力和軸向張力。對于血管承受的流體剪切應(yīng)力，即流動的血液順血流方向作用于腔側(cè)血管內(nèi)皮細胞單位面積上的力，尚無法模擬，而這種力的作用對形成完整而牢固的內(nèi)皮細胞層，以達到穩(wěn)定血流與抗血栓的作用是至關(guān)重要的。因此，進一步研究的重點之一，就是完善生物反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)，使之能模擬流體剪切應(yīng)力作用，以使其能完全模擬體內(nèi)流體作用環(huán)境。

血管本身的生長發(fā)育是一個緩慢而復(fù)雜的過程，其生物力學(xué)性能也是隨著血管的不斷生長，在血流的不斷作用下而逐漸提高的。體外生物反應(yīng)器的應(yīng)用只是給予細胞—材料復(fù)合物以理想的啟動環(huán)境，使其在形成組織工程化血管的生長發(fā)育過程中更接近體內(nèi)的環(huán)境。其實，構(gòu)建組織工程化血管的最終目的還是要將其回植于體內(nèi)，用于修復(fù)血管缺損，而體內(nèi)的大環(huán)境才是血管生長成熟的最佳環(huán)境，體內(nèi)真正的血流刺激才是最有效的作用因素。生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)8周形成的血管組織已基本成熟，結(jié)構(gòu)完整，并且具有一定的生物力學(xué)性能，下一步實驗中可將其回植體內(nèi)，使其在血流的作用下，進一步生長發(fā)育，在適當(dāng)?shù)捏w內(nèi)環(huán)境下達到完善和提高。

本實驗結(jié)果表明，在構(gòu)建組織工程血管中，應(yīng)力對血管平滑肌的生長增殖具有一定的促進作用，可以刺激平滑肌細胞生長、增殖與分化，促進細胞定向排布，增加膠原含量，從而增加平滑肌細胞收縮特性，有利于組織形成及細胞適應(yīng)性再塑，也更有利于內(nèi)皮細胞的復(fù)合。本實驗還證實，在生物反應(yīng)器輔助下，體外可構(gòu)建具有完整組織學(xué)結(jié)構(gòu)的組織工程化血管，為下一步的體內(nèi)回植實驗奠定了基礎(chǔ)。

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Experimental Study on Tissue Engineered Blood Vessel with Bioreactor

XU Zhicheng1,ZHANG Wenjie1,LI Hong2, ZHOU Guangdong1,CUI Lei2,LIU Wei1,CAO Yilin1.
1 Department of Plastic and Reconstructive Surgery,The Ninth People′s Hospital,Shanghai Jiaotong University Schoolof Medicine,Shanghai 200011,China.2 Shanghai Tissue Engineering Research and Development Center，Shanghai 200235,China.Corresponding author:CAO Yilin.

ObjectiveTo investigate the feasibility of constructing tissue engineered blood vessels with bioreactor.MethodsCell-PGA(polyglycolic acid)complex was constructed by seeding smooth muscle cells(SMCs)isolated from canine carotid artery on PGA unwoven fibers.The cell-PGA complex was cultured in a bioreactor(pulse rate:75/min，radical distension＜5%).Eight weeks after culture in vitro,Endothelial cells(ECs)isolated from canine carotid vein were seeded on PGA and cultured for another 5 days.The control group was not seeded ECs.Tissue engineered blood vessels were harvested and examined.ResultsHistological staining revealed layered smooth muscle fibers and integral ECs in the tissue engineered blood vessel wall，which was further confirmed by immuno-histological staining.There were no obvious ECs were observed in the control group.ConclusionThe technology of bioreactor could be used to build tissue engineered blood vessel with mimic native blood vessel.

Tissue engineering;Bioreactor;Blood vessel;Reconstruction

Q813.1+2

A

1673－0364（2009）03－0134－04

2009年2月13日；

2009年4月1日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.06.005

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展規(guī)劃項目（2005CB522700）。

200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整形外科（許志成，張文杰，周廣東，劉偉，曹誼林）；200235上海市上海組織工程研究與開發(fā)中心（李宏，崔磊）。

曹誼林。