植物功能基因組的主要研究方法及其應(yīng)用

王　丹　楊　宇

摘要概述了植物基因功能的主要研究方法，并論述了主要技術(shù)如cDNA微陣列與基因芯片技術(shù)、反向遺傳學(xué)技術(shù)、表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)、蛋白質(zhì)組學(xué)、生物信息學(xué)等及其應(yīng)用。

關(guān)鍵詞植物功能基因組；方法；應(yīng)用

中圖分類號(hào)Q943文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼B文章編號(hào) 1007-5739(2009)01-0277-02

基因組學(xué)(genomics)指對(duì)所有基因進(jìn)行基因組作圖、核苷酸序列分析、基因定位和基因功能分析的一門科學(xué)[1，2]。許多生物全基因組的破譯，使基因組學(xué)的研究有了一次質(zhì)的突破：從結(jié)構(gòu)基因組學(xué)開始過渡到功能基因組學(xué)。結(jié)構(gòu)基因組學(xué)(structural genomics)是通過基因作圖、核苷酸序列分析以確定基因組成、基因定位的一門科學(xué)。功能基因組學(xué)(functional genomics)代表基因組分析的新階段，被稱為后基因組學(xué)(post genomics)，旨在利用結(jié)構(gòu)基因組學(xué)豐富的信息資源，應(yīng)用高通量、大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)分析方法，結(jié)合統(tǒng)計(jì)和計(jì)算機(jī)分析來研究基因的表達(dá)、調(diào)控與功能，基因間、基因與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與底物、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用以及生物的生長(zhǎng)、發(fā)育等規(guī)律[3]。

傳統(tǒng)的遺傳學(xué)的方法已不能適應(yīng)現(xiàn)在基因組學(xué)的發(fā)展，cDNA微陣列(cDNA micro-array)和基因芯片(gene chip)法、反向遺傳學(xué)、表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed sequence Tag，EST)、蛋白質(zhì)組學(xué)、生物信息學(xué)等方法相繼誕生，為基因組學(xué)的研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1cDNA微陣列與基因芯片法

cDNA微陣列和基因芯片都是基于Reverse Northern雜交以檢測(cè)基因表達(dá)差異的技術(shù)。二者的基本原理是利用光導(dǎo)化學(xué)合成、照相平板印刷以及固相表面化學(xué)合成等技術(shù)，在固相支持物上固定成千上萬個(gè)cDNA、EST或基因特異的寡核苷酸探針，并與放射性同位素或熒光標(biāo)記的靶DNA進(jìn)行雜交，然后用相應(yīng)的檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)雜交信號(hào)強(qiáng)弱及探針的位置和序列，即可確定靶DNA的表達(dá)情況以及突變和多態(tài)性的存在。該技術(shù)優(yōu)點(diǎn)在于可以同時(shí)對(duì)大量基因，甚至整個(gè)基因組基因的表達(dá)差異進(jìn)行對(duì)比分析。

1.1基因表達(dá)水平的檢測(cè)及表達(dá)圖譜的構(gòu)建

基因芯片技術(shù)可以清楚地直接快速定量檢測(cè)出細(xì)胞內(nèi)幾個(gè)拷貝到幾個(gè)數(shù)量級(jí)拷貝的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，而且還可以檢測(cè)出外界因素誘導(dǎo)下基因表達(dá)水平變化[4]。由于微陣列技術(shù)可以同時(shí)在同一水平下大規(guī)模地、定量地檢測(cè)，因而可以檢測(cè)出目的基因在不同器官中的表達(dá)差異，也能檢測(cè)出同一器官在不同時(shí)期的表達(dá)差異，并在此基礎(chǔ)上繪制相關(guān)的表達(dá)圖譜，以找出基因型和表現(xiàn)型之間的關(guān)系，有助于全面了解基因的表達(dá)狀況[5]。

1.2功能相關(guān)基因的檢測(cè)及新基因的發(fā)現(xiàn)

通過對(duì)受檢樣品表達(dá)圖譜的成對(duì)比較，可以建立性狀與基因的可能聯(lián)系，鑒別目標(biāo)性狀基因；也可識(shí)別特定生理或代謝途徑中相互作用的相關(guān)基因群。構(gòu)建cDNA文庫(kù)，對(duì)野生型和突變體的植株進(jìn)行雜交篩選，發(fā)現(xiàn)其差異表達(dá)序列后，從文庫(kù)中找出相應(yīng)的克隆，以判斷它是否是新的基因[6]。

1.3轉(zhuǎn)基因的檢測(cè)

采用基因芯片技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因作物中常見的啟動(dòng)子、終止子和選擇標(biāo)記基因等多個(gè)外源基因進(jìn)行檢測(cè)，可以建立快速、準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)基因作物篩選鑒定技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA的準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測(cè)。

2反向遺傳學(xué)(reverse genetics)

傳統(tǒng)的遺傳學(xué)或稱為正向遺傳學(xué)(forward genetics)主要研究自發(fā)或誘變突變體中某一突變性狀的遺傳行為。而反向遺傳學(xué)(reverse genetics)是相對(duì)正向遺傳學(xué)而言的，是在基因功能序列已知的基礎(chǔ)上分析研究基因功能，一般通過創(chuàng)造功能喪失突變體來研究突變所造成的表型效應(yīng)，并推測(cè)在生物體內(nèi)基因的作用。

2.1基因陷阱(Gene trap)

基因陷阱是新近發(fā)展起來的一種反向遺傳學(xué)方法，它主要依靠報(bào)道基因的隨機(jī)插入來產(chǎn)生融合轉(zhuǎn)錄物或融合蛋白，通過檢測(cè)報(bào)道基因而推知基因及其功能。目前已發(fā)展了3種不同的陷阱系統(tǒng)，即增強(qiáng)子陷阱、啟動(dòng)子陷阱和基因陷阱。它們之間最大的不同體現(xiàn)在報(bào)道基因重組體的組成和所插入基因組的位置上?；蛳葳宓膬?yōu)勢(shì)在于它只在表達(dá)水平上定位基因，細(xì)胞基因本身的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)不受影響，所以可檢測(cè)功能上多余的基因，也可檢測(cè)在基因表達(dá)多個(gè)水平上都有作用的基因，或低水平表達(dá)的重要基因，而以前的功能基因組學(xué)的方法對(duì)這些基因都是無法確定的。

2.2TILLING技術(shù)

TILLING(Targeting Induced Local Lesions In Genomes)即定向誘變基因組局部突變技術(shù)，其基本原理是：誘變實(shí)驗(yàn)對(duì)象并提取DNA，把多個(gè)待測(cè)樣品的DNA混合在一起進(jìn)行PCR，通過變性和復(fù)性過程得到異源雙鏈。如果樣品發(fā)生突變，那么形成的異源雙鏈中必定含有錯(cuò)配堿基。利用特異性的內(nèi)切核酸酶識(shí)別攜帶了錯(cuò)配堿基的異源雙鏈，并在錯(cuò)配處切開雙鏈，最后進(jìn)行電泳檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果。TILLING作為一種全新的反向遺傳學(xué)研究方法已經(jīng)用于多種植物及作物中，如擬南芥、玉米、水稻等。以美國(guó)為首的北美實(shí)驗(yàn)室借助TILLING技術(shù)，聯(lián)合啟動(dòng)了擬南芥菜TILLING項(xiàng)目，直接推動(dòng)了擬南芥功能基因組學(xué)項(xiàng)目的建立。該項(xiàng)目在立項(xiàng)的第1年就為擬南芥研究者們提供了超過100個(gè)基因上的1 000多個(gè)突變位點(diǎn)。隨著各種生物基因組計(jì)劃的深入研究，相信TILLING技術(shù)將會(huì)得到更加廣泛的應(yīng)用。

2.3RNA干涉技術(shù)(RNAi)

RNA干涉是指細(xì)胞內(nèi)的RNAi被內(nèi)、外源雙鏈RNA(dsRNA)激活，高度特異地抑制同源基因表達(dá)的現(xiàn)象，是真菌、動(dòng)物、植物等大多數(shù)真核生物中普遍存在的一種防御反應(yīng)。RNAi已成功地應(yīng)用于單個(gè)基因和基因家族中的多個(gè)成員的沉默，植物中運(yùn)用轉(zhuǎn)基因所形成的RNAi可以遺傳到下一代，產(chǎn)生基因表達(dá)效應(yīng)較低的轉(zhuǎn)基因植物，導(dǎo)致植物表現(xiàn)出相應(yīng)的缺失表型。因此，RNAi技術(shù)具有高度的序列專一性和有效的干擾活力，可以特異地使特定基因沉默，獲得功能喪失或降低的突變體，已成為功能基因組學(xué)的一種強(qiáng)有力的研究工具。

3表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)

表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)是指從不同組織來源的cDNA文庫(kù)中隨機(jī)挑取克隆，對(duì)其進(jìn)行大規(guī)模測(cè)序所獲得的部分cDNA的5′或３′ 序列，一個(gè)EST對(duì)應(yīng)于某一種mRNA的cDNA克隆的一段序列，長(zhǎng)度一般為300～500bp。近幾年來，EST已經(jīng)成為分離與克隆新基因及基因功能研究的一個(gè)行之有效的手段。然而只有少數(shù)模式植物測(cè)定了基因組序列，在大基因組的植物無法進(jìn)行全序列測(cè)定的情況下，EST已經(jīng)成為一種進(jìn)行基因序列比較，發(fā)現(xiàn)和鑒定表達(dá)基因的最快的途徑[7]。由于EST代表著一段表達(dá)的基因序列，可與公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因進(jìn)行“電子雜交”(electric hybridization)，進(jìn)而可以從理論上推測(cè)其所代表的基因的功能，因此可部分替代基因組成為科學(xué)研究的資源或作為全基因組研究的補(bǔ)充[8，9]。功能基因在進(jìn)化過程中具有保守性，根據(jù)序列同源性可由數(shù)據(jù)庫(kù)中大量已知EST的功能來推測(cè)未知EST的功能。

4蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics)

蛋白質(zhì)組學(xué)表示基因組編碼的蛋白質(zhì)的全部集合?；虮磉_(dá)的產(chǎn)物是蛋白質(zhì)，但基因和蛋白質(zhì)之間也不是一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系，蛋白質(zhì)翻譯后還要經(jīng)過修飾、加工、細(xì)胞定位或與其他蛋白質(zhì)相互作用才具有生物功能，因而隨著后基因組學(xué)時(shí)代的到來，對(duì)蛋白質(zhì)功能的研究必將會(huì)從對(duì)特定蛋白質(zhì)的研究上升到對(duì)生物體全部蛋白質(zhì)的表達(dá)模式及功能模式的研究，即蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。近幾年來，蛋白質(zhì)芯片技術(shù)(protein chip)的出現(xiàn)給蛋白質(zhì)組學(xué)研究帶來了新思路。這種技術(shù)在體外條件下進(jìn)行操作，并直接檢測(cè)目標(biāo)蛋白質(zhì)，不需要酵母作為中介，突破了酵母雙雜交系統(tǒng)技術(shù)的局限性，因此必將成為全新的研究蛋白質(zhì)相互作用的理想工具。

5展望

綜上所述，植物功能基因組學(xué)已經(jīng)取得了一定進(jìn)展，上述研究方法也只是功能基因組學(xué)研究中的一部分，各種方法都各有側(cè)重點(diǎn)也有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，可以相互輔助?；蚪M研究的深入和國(guó)際合作的加強(qiáng)，現(xiàn)有的研究手段將會(huì)不斷完善和加強(qiáng)，也將會(huì)不斷研發(fā)出新的研究技術(shù)，數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)也將會(huì)更趨豐富和共享度會(huì)更高，最終研究清楚植物基因組的結(jié)構(gòu)及功能。目前利用功能基因組學(xué)的方法進(jìn)行植物體發(fā)育過程中基因功能的研究，植物體內(nèi)致病基因和程序性死亡有關(guān)基因的研究等還很少，這也為植物功能基因組的研究提供了更為廣闊的應(yīng)用空間。相信植物功能基因組研究方法的應(yīng)用將會(huì)大大促進(jìn)疾病治療的研究，植物抗病毒研究的發(fā)展，也相信植物功能基因組研究方法在各研究領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用將為其轉(zhuǎn)化成生產(chǎn)力打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，為農(nóng)業(yè)發(fā)展做出更大的貢獻(xiàn)。

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