西瓜EST-SSR分子標(biāo)記的篩選

鄒明學(xué) 陳艷紅 徐勇 郭紹貴 張海英 宮國(guó)義

（1.南通大學(xué)，江蘇南通，226007；2.國(guó)家蔬菜工程技術(shù)研究中心）

西瓜EST-SSR分子標(biāo)記的篩選

鄒明學(xué)1陳艷紅1徐勇2郭紹貴2張海英2宮國(guó)義2

（1.南通大學(xué)，江蘇南通，226007；2.國(guó)家蔬菜工程技術(shù)研究中心）

利用國(guó)際共享獲得的820條EST序列，自主設(shè)計(jì)出79對(duì)EST-SSR引物，其中有32對(duì)引物經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增出穩(wěn)定清晰的電泳條帶，可以作為西瓜和相關(guān)物種的新的EST-SSR分子標(biāo)記。

西瓜 EST-SSR 分子標(biāo)記

我國(guó)是西瓜生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，西瓜播種面積占世界的60%，西瓜的栽培在我國(guó)的農(nóng)村經(jīng)濟(jì)發(fā)展中起著越來(lái)越重要的作用。近年來(lái)，以RFLP，RAPD，SSR，ARLP為代表的分子標(biāo)記的發(fā)展為遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建開(kāi)創(chuàng)了新局面。EST-SSRs分子標(biāo)記的出現(xiàn)使無(wú)功能分子標(biāo)記向可揭示基因轉(zhuǎn)錄功能的分子標(biāo)記轉(zhuǎn)化[1]。作為功能基因的一部分序列，它比其他分子標(biāo)記提供了更多的功能信息，從而使研究者對(duì)影響該性狀變異的生物學(xué)途徑和代謝機(jī)制有更了深層次的認(rèn)識(shí)[2]。由此可見(jiàn)，EST方法的優(yōu)點(diǎn)就在于它能大大縮小基因的篩選范圍，提高分離基因的效率。目前GenBank上有數(shù)量龐大的EST序列數(shù)據(jù)，為EST-SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)提供了一個(gè)巨大而有價(jià)值的來(lái)源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試西瓜EST-SSR標(biāo)記篩選的親本材料為：父本為野生西瓜（（thunb.）Mansfeld）品種，由美國(guó)Clemson大學(xué)Rhodes B B教授贈(zèng)送，代號(hào)為PI296341，目前它是國(guó)際上唯一一份高抗枯萎?。‵usarium wilt）3個(gè)生理小種的材料；母本為感枯萎病的普通西瓜（（Thunb.）Mansfeld var.）品種97103。

1.2 試驗(yàn)方法

①基因組DNA的提取 參照Murry和Tompson（1980）的CTAB方法進(jìn)行。

②EST-SSR序列的獲取 本項(xiàng)研究從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得820條西瓜EST序列。登陸網(wǎng)站http://www. gramene.org/gremene/searches/ssrtool，應(yīng)用SSRIT（Simple Sequence Repeat Identification Tool）軟件在線搜索EST-SSR，搜索的標(biāo)準(zhǔn)為：二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)分別大于或等于10，7，5，4。

③EST-SSR引物的設(shè)計(jì) 應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件Premier 5.0設(shè)計(jì)引物。引物設(shè)計(jì)的原則為：EST序列長(zhǎng)度大于100 bp；SSR序列的開(kāi)始和結(jié)束位置分別距5＇和3＇端不少于20 bp；引物中（G+C）的比例為40%～60%，退火溫度（）為54～60℃，引物長(zhǎng)度16～20 bp，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為80～400 bp。盡量避免引物二級(jí)結(jié)構(gòu)dimer，hairpin，false primer以及連續(xù)6個(gè)堿基配對(duì)的出現(xiàn)。

④SSR擴(kuò)增與產(chǎn)物的檢測(cè) SSR擴(kuò)增體系：總反應(yīng)體系為12.5 μL，其中dNTP（2.5 mmol/L）1.0 μL，引物（15 ng/μL）2.0 μL，模板DNA（30 ng/μL）2.0 μL，rTaqE （5 U/μL）0.2 μL，10 buffer（含 Mg2+）1.25 μL，ddH2O 6.05 μL。

SSR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min；4℃保存。

SSR擴(kuò)增產(chǎn)物用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯色后對(duì)結(jié)果進(jìn)行記錄并分析。

2 結(jié)果與分析

根據(jù)與國(guó)際合作單位共享獲取的820條EST序列，共設(shè)計(jì)了79對(duì)EST-SSR引物。用自主設(shè)計(jì)的EST-SSR引物對(duì)PI296341，97103和它們的F1代進(jìn)行EST-SSR多態(tài)性引物篩選 （每3個(gè)泳道為一對(duì)引物，泳道順序從左自右分別是父本、母本、F1），結(jié)果如圖1所示。

圖1 EST-SSR引物篩選銀染照片（從左至右為WEP1～WEP28）

經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增、聚丙烯酰胺凝膠電泳和硝酸銀染色，共有32對(duì)引物顯示出穩(wěn)定清晰的電泳條帶，可以作為西瓜和相關(guān)物種的新的EST-SSR分子標(biāo)記。

EST-SSR引物雖然是經(jīng)過(guò)嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)合成的，但仍然有23對(duì)引物沒(méi)有擴(kuò)增結(jié)果或者擴(kuò)增主帶不明顯，原因可能一方面是引物的序列結(jié)合到2個(gè)外顯子上；另一方面可能是2個(gè)引物間有一個(gè)長(zhǎng)的內(nèi)含子致使不能擴(kuò)增出產(chǎn)物。還有一些擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期產(chǎn)物長(zhǎng)度不一致，可能一是所分析的材料中存在復(fù)等位基因，盡管編碼區(qū)相同但是DNA序列不一定相同，擴(kuò)增出的產(chǎn)物與預(yù)期的產(chǎn)物大小不同；二是引物特異性不夠高，擴(kuò)增出引物的同源序列。

EST-SSR引物由于國(guó)際合作原因目前暫不能公開(kāi)。

3 小結(jié)與討論

EST-SSR標(biāo)記是基于EST或cDNA數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)的一種分子標(biāo)記。作為一種新型分子標(biāo)記，EST-SSR來(lái)自表達(dá)基因，因而除具備傳統(tǒng)基因組來(lái)源的SSR標(biāo)記所有優(yōu)勢(shì)外，可能與基因功能表達(dá)具有直接或間接關(guān)系，從而強(qiáng)化了SSR標(biāo)記在遺傳研究中的應(yīng)用。Levi A等于2007-2008年利用西瓜EST-SSR標(biāo)記進(jìn)行了EST-SSR分子標(biāo)記在葫蘆科種間轉(zhuǎn)移可能性方面和遺傳多樣性等方面的研究[3～4]，Verma M等2008年進(jìn)行了西瓜EST-SSR標(biāo)記尋找方面的研究[5]。本研究利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取西瓜的EST序列設(shè)計(jì)引物，利用抗枯萎病PI296341與感枯萎病的97103及它們雜交獲得的F1代進(jìn)行EST-SSR標(biāo)記的篩選，是國(guó)內(nèi)在西瓜研究中首次利用已經(jīng)有的EST序列進(jìn)行EST-SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用方面的研究，以期為以后的西瓜及葫蘆科其他作物的EST-SSR標(biāo)記的發(fā)展作出重要貢獻(xiàn)。

由于目前西瓜的EST序列還比較少，可以用來(lái)開(kāi)發(fā)EST-SSR標(biāo)記的也還較少，隨著西瓜及葫蘆科其他作物的EST序列的豐富，利用EST-SSR標(biāo)記的通用性借鑒葫蘆科其他作物的EST-SSR引物對(duì)，會(huì)有更多的西瓜EST-SSR標(biāo)記得到開(kāi)發(fā)和利用，同時(shí)利用SSR標(biāo)記的通用性，也可以將西瓜的SSR標(biāo)記和EST-SSR標(biāo)記應(yīng)用到葫蘆科其他物種上。

[1]Stack S，Campbell L，Henderson K，et al.Development of EST-derived microsatellitemarkersformapping and germplasm analysis in wheat[C].San Diego，California，USA：Plant&Animal GenomeⅧ Conference，January，2000：9-12.

[2]朱振東，賈繼增.小麥SSR標(biāo)記的發(fā)展及應(yīng)用[J].遺傳，2003，25（3）：355-360.

[3]Levi A,Patrick W,Davis A,et al.Interspecific transferability of watermelon EST-SSR markers in cucurbit species[J]. Hortscience,2007,42(4):1012.

[4]Levi A,Ling K,Davis A R.Est-ssrs of watermelon(citrullus sp.)useful in assessing genetic diversity among lagenaria siceraria accessions[J].Plant and Animal Genome Conference Proceedings,2008(1):643.

[5]Verma M,Arval L.Development of EST-SSRs in watermel-and their transferability tospp.[J].Journal of horticul science&biotechnology,2008,83(6):732-736.

Selection of Watermelon EST-SSR Molecular Marker

ZOU Mingxue1,CHEN Yanhong1,XU Yong2,GUO Shaogui2,ZHANG Haiying2,GONG Guoyi2

From 820 ESTs of watermelon,we have identified 87 ESTs containing perfect simple sequence repeats(SSR)of di-,tri-,tetra-or pentanucleotides.79 EST-SSR primer pairs were designed for watermelon based on the searching results.Through PCR amplifications and silver detection,32 primer pairs had successful and distinctive bands in different cultivars of watermelon.These EST-SSR markers can be taken as a new molecular marker of watermelon and related species.

Watermelon;EST-SSR;Molecular marker

10.3865/j.issn.1001-3547.2009.18.004

鄒明學(xué)（1973-），男，碩士，助教，研究方向?yàn)榉肿舆z傳學(xué)，電話:0513-85015438，13912299027。E-mail:greatdream001@126.com

2009-07-01