人表皮黑素細胞與ＨａＣａＴ細胞共培養(yǎng)體外模型的建立

馬慧軍　田　燕　劉　雯　李　鈾　趙　廣　楊慶琪

[摘要]目的：建立人表皮黑素細胞與HaCaT細胞共培養(yǎng)的體外模型，觀察α-促黑素以及煙酰胺對黑素在兩細胞間傳遞的影響。方法：分別培養(yǎng)人表皮黑素細胞和HaCaT細胞，接種黑素細胞48h后再將HaCaT細胞以1∶2的比例與黑素細胞共培養(yǎng)，分別以不同濃度的α-促黑素和煙酰胺干預共培養(yǎng)的細胞9天，F(xiàn)ontana-Masson 銀染法觀察共培養(yǎng)模型中黑素顆粒在兩細胞間傳遞的情況。結果：培養(yǎng)3天即可觀察到約20%HaCaT細胞核周圍出現(xiàn)從鄰近黑素細胞傳遞來的黑素顆粒，隨著時間的延長陽性染色HaCaT細胞比例逐漸增多，第7天達到高峰（約80%），α-促黑素以及煙酰胺分別以濃度依賴方式促進/抑制了黑素顆粒在兩細胞間的傳遞。結論：成功建立了人表皮黑素細胞與HaCaT細胞共培養(yǎng)體外模型，為大規(guī)模篩選促/抑黑素傳遞的藥物奠定了實驗基礎。

[關鍵詞]黑素細胞；共培養(yǎng)；HaCaT細胞；黑素傳遞

[中圖分類號]Q813.1[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2009）02-0188-03

Establishment of the co-culture model of human melanocyte and HaCaT cell in vitro

MA Hui-jun, TIAN Yan, LIU Wen, LI You, ZHAO Guang,YANG Qing-qi

(Department of Dermatology, The Airforce General Hospital of PLA, Beijing 100142,China)

Abstract:ObjectiveTo establish an in vitro model of melanocyte and HaCaT cell co-culture model, and measured the melanin transfer effects induced by α-MSH and niacinamide using the model.MethodsHuman epidermal melanocyte was co-culture with HaCaT cell as 1∶2 ratio after 48 h of melanocyte first seeding on the dishes. Then melanin transfer was observed with Fontana-Masson method byα-MSH and niacinamide after 1,3,5,7,9 day of co-culture separately . ResultsAbout 20% HaCaT cells that have positive melanin stain around nuclear were observed after 3 day's co-culture. With the time developed, the ratio of positive melanin stained HaCaT cell is increasing and reached its peak (80%) at the 7th day. In our model, the dose-dependent inhibitory and facilitative effects were observed respectively in niacinamide and α-MSH treated group.ConclusionsThe in vitro model of epidermal melanocyte and HaCaT cell co-culture system was successfully established and it offers a new, suitable, reliable and easy tool for the clinical evaluation of melanin transfer modulators.

Key words：melanocyte; co-culture; HaCaT cell; melanosome transfer

表皮中的黑素細胞和角質形成細胞相互作用共同組成了表皮黑素單元，起著重要的調節(jié)皮膚顏色、防止紫外線輻射的作用。目前研究表明，人皮膚顏色主要受色素沉著過程的影響，除黑素細胞生成黑素外，黑素小體從黑素細胞向周圍角質形成細胞的廣泛傳遞過程在皮膚顏色調節(jié)中起著更為重要的作用[1]。目前黑素傳遞的研究多采用鼠系的瘤細胞或正常人表皮黑素細胞和角質形成細胞共培養(yǎng)來完成，但這兩種共培養(yǎng)方法均有各自的局限性，限制了該方法在藥物篩選中的廣泛應用[2]。HaCaT細胞是成人皮膚中分離的一種永生化的角質形成細胞株，具有正常角質形成細胞所應有的特性，常用來替代人表皮角質形成細胞進行實驗研究[3]。筆者通過不斷的摸索和比較，將人表皮黑素細胞和HaCaT細胞進行了共同培養(yǎng)，并觀察了α-促黑素（α-MSH）、煙酰胺對該共培養(yǎng)模型黑素傳遞的影響，為大規(guī)模篩選促/抑黑素傳遞的藥物提供了實驗基礎。

1材料和方法

1.1 材料

1.1.1 標本：正常人表皮黑素細胞來源于空軍總醫(yī)院泌尿外科門診行包皮環(huán)切術的青少年（10～19歲，平均14.4歲）包皮；HaCaT細胞購自上海滬尚生物科技有限公司。

1.1.2試劑和儀器：DMEM培養(yǎng)基、MCDB153培養(yǎng)基、胰蛋白酶、角質形成細胞無血清培養(yǎng)基（keratinocyte serum free medium, KSFM）均為美國Gibco公司產品，進口胎牛血清（FCS）購自?？寺∩锘瘜W制品有限公司，左旋谷氨酰胺、分離酶（dispase）、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)， 神經生長因子-β (NGF-β)，內皮素 1(ET-1)，霍亂毒素（CT），α-MSH、煙酰胺(Vpp)購自美國Sigma公司；分析純硝酸銀（常州市武進廟橋第二化工有限公司），純氨水（天津市化學試劑一廠），25cm培養(yǎng)瓶、6孔培養(yǎng)板（美國Corning公司）。CKX31-A12PHP倒置顯微鏡、BX51TF顯微鏡（Olympus公司），F(xiàn)orma-3111 CO2孵箱（鑫態(tài)國際貿易有限公司）

1.2 方法

1.2.1 原代黑素細胞的純化和培養(yǎng)：取包皮，碘伏消毒10 min，PBS洗滌3次，去除皮下組織，將包皮剪成1cm×1cm的小片，0.25%分離酶4℃放置12～16h，眼科鑷輕輕分離表真皮，用0.25%的胰酶37℃消化表皮5～10min，吹打成細胞懸液，200目篩網(wǎng)過濾，PBS洗滌2次，參照以前的方法[4]稍加改良，用含5%胎牛血清、100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素， 50nM CT，5ng/ml bFGF，10ng/ml NGF-β，20μg/ml ET-1的MCDB153培養(yǎng)基稀釋細胞，以4×105/ml的細胞密度接種到25cm的培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。14～18天后待細胞長至80%融合狀態(tài)時傳代，0.05%胰酶消化細胞5min，見黑素細胞收縮浮起，即可用含血清的培養(yǎng)基中和胰酶，離心收集細胞懸液，傳代培養(yǎng)，取2～4代的表皮黑素細胞用于實驗。

1.2.2 HaCaT細胞培養(yǎng)：HaCaT細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，每3～4天傳代1次。

1.2.3表皮黑素細胞與HaCaT細胞共培養(yǎng)：將已純化的表皮黑素細胞消化離心后以2×104/ml的細胞密度貼壁培養(yǎng)于已消毒的蓋玻片上，添加黑素細胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h后，將HaCaT細胞消化離心調整細胞密度為4×104/ml，接種于已有黑素細胞生長的蓋玻片上，更換培養(yǎng)基為KSFM(添加牛垂體浸出物，表皮生長因子等），2天 換液1次，倒置顯微鏡下觀察共培養(yǎng)細胞生長及形態(tài)學變化。

1.2.4 色素調節(jié)劑干預：根據(jù)文獻[5]，分別選擇α-MSH( 10，50，100nM)以及煙酰胺(0.1，0.5，1mg/ml) 于共培養(yǎng)當天添加入角質形成細胞無血清培養(yǎng)基中，藥物連續(xù)干預3天，中間換含有藥液的培養(yǎng)基1次，未添加藥物的培養(yǎng)基作為空白對照，觀察黑素細胞形態(tài)，檢測黑素傳遞。

1.2.5 Fontana-masson 染色[6]：分別取經藥物干預或無藥物干預（空白對照）1，3，5，7，9天后黏附有共培養(yǎng)細胞的蓋玻片，浸入PBS中5min，4%多聚甲醛固定20min，蒸餾水沖洗3次，入5%硝酸銀-氨水溶液中56℃避光孵育1h，蒸餾水沖洗，1%氯化金溶液10min加強著色，蒸餾水沖洗，入5%硫代硫酸鈉溶液還原3min，0.1%伊紅復染1min，水溶性封片劑封片，顯微鏡下觀察并攝片，計數(shù)在400倍光鏡下隨意15個視野中陽性染色的HaCaT細胞總數(shù)。黑素傳遞量以處理組陽性HaCaT細胞數(shù)/空白對照組陽性HaCaT細胞數(shù)×100%表示，每一實驗重復4次。

1.2.6 統(tǒng)計學分析：統(tǒng)計過程使用SPSS10.0統(tǒng)計軟件完成，采用t檢驗，數(shù)據(jù)均以x±s表示。

2結果

2.1表皮黑素細胞與HaCaT細胞在倒置顯微鏡下的形態(tài)：表皮黑素細胞在本實驗選用的培養(yǎng)基中多呈樹突狀生長，每個細胞有2～4個突起，細胞增殖較快約18天傳1代；HaCaT細胞多呈鵝卵石樣或菱形生長，具有緊密黏附生長的特性，HaCaT細胞增殖快，約4天傳1代。

2.2 表皮黑素細胞與HaCaT細胞共培養(yǎng)在倒置顯微鏡下的形態(tài)：黑素細胞與HaCaT細胞共培養(yǎng)第1天始HaCaT逐漸增多，第9天達到融合狀態(tài)，而黑素細胞的數(shù)量未有增加，相反隨著培養(yǎng)時間的延長，黑素細胞數(shù)量有所減少，細胞間發(fā)生的接觸增多，黑素細胞胞體也變成多角狀，樹突逐漸延長、突起增多，常有3～6個樹突與周圍多個HaCaT細胞發(fā)生接觸（圖1）。

2.2 Fontana-Masson 染色顯示黑素顆粒：共培養(yǎng)第1天，HaCaT細胞內未見明顯的黑素顆粒（圖2a），第3天可見20%的HaCaT細胞核周出現(xiàn)明顯黑素顆粒(圖2b)，第7天約80%的HaCaT細胞核周出現(xiàn)明顯黑素顆粒(圖2c)，繼續(xù)培養(yǎng)則未見含有黑素顆粒的HaCaT細胞比例明顯增加。

2.3 α-促黑素、煙酰胺對黑素傳遞的影響：共培養(yǎng)3天后，α-促黑素以濃度依賴方式促進了黑素細胞內黑素向HaCaT細胞內的傳遞， 10、50、100 nMα-MSH分別使黑素傳遞量增加為130%、150%和165%；煙酰胺則以濃度依賴方式抑制了兩細胞間黑素的傳遞，0.1、0.5、1mg/ml煙酰胺分別使黑素傳遞量遞減為90%、83%、67%（圖3）。

3討論

黑素在黑素細胞體內合成后以黑素小體的形式傳遞到周圍的角質形成細胞并在角質形成細胞內重新分布和降解，從而起到調節(jié)皮膚顏色、抑制紫外線輻射的作用，此過程被稱為黑素傳遞。黑素傳遞過程通過調節(jié)角質形成細胞中傳遞的黑素小體的大小、數(shù)量和分布從而影響著人的皮膚顏色[1]。目前，大多數(shù)的美白產品主要是是通過抑制黑素細胞內的黑素合成來發(fā)揮作用的，僅發(fā)現(xiàn)極少數(shù)美白劑如煙酰胺等具有抑制黑素小體向角質形成細胞內傳遞的作用。由于有關黑素傳遞的研究起步較晚，其確切的機制還遠未被人們所認識。

以表皮中黑素細胞與角質形成細胞或各自對應的鼠瘤細胞進行共培養(yǎng)建立體外細胞模型是目前研究黑素傳遞的主要方法，但上述方法均存在一定的缺陷（如鼠源性的瘤細胞與人表皮細胞尚存在較大差異；原代人角質形成細胞培養(yǎng)增殖慢、不易純化、傳代易死亡等缺點），嚴重影響了該方法在大規(guī)模篩選黑素傳遞調節(jié)藥物中的應用[2]。因此需要建立一種簡便、快捷、與人生理狀態(tài)最為接近的細胞模型來替代既往的細胞模型。我們在以前成功純化培養(yǎng)表皮黑素細胞的基礎上，經過不斷的摸索和實踐，將原代培養(yǎng)的人表皮黑素細胞與HaCaT細胞進行混合培養(yǎng)，并應用較為簡便的Fontana-Masson銀染法對共培養(yǎng)后的細胞是否發(fā)生了黑素傳遞進行了初步驗證，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)細胞在KSFM培養(yǎng)基中生長狀態(tài)良好，隨著時間的延長黑素細胞的比例逐漸減少而HaCaT細胞的比例逐漸增加，兩細胞間的聯(lián)系逐漸增多。與單獨培養(yǎng)的黑素細胞相比，共培養(yǎng)的黑素細胞胞體變成多角狀，樹突逐漸延長、突起增多，常有3～6個突起與周圍HaCaT細胞發(fā)生接觸。提示共培養(yǎng)體系中HaCaT細胞可通過細胞接觸發(fā)揮對黑素細胞的調控作用，這與體內情況相一致[7]。我們還發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)3天后約20%的HaCaT細胞核周發(fā)現(xiàn)由黑素細胞傳遞來的黑素顆粒。共培養(yǎng)7天后黑素傳遞量達到飽和狀態(tài)（約80%），繼續(xù)培養(yǎng)則未見含有黑素顆粒的HaCaT細胞比例再增加。說明黑素細胞與HaCaT細胞間的黑素傳遞在細胞接觸后即可發(fā)生，當兩細胞間的接觸達到完全狀態(tài)后，黑素傳遞也相應達到飽和。為了進一步驗證該模型的敏感性，我們利用既往已經證實的兩種黑素傳遞調節(jié)劑增殖α-MSH和煙酰胺對該模型進行了測試，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)3天后，α-MSH以濃度依賴方式促進了黑素細胞內黑素向HaCaT細胞內的傳遞，煙酰胺則以濃度依賴方式抑制了兩細胞間黑素的傳遞，與以往的研究結果基本一致[5]，從而說明該共培養(yǎng)模型可很好的模擬人生理狀態(tài)下表皮黑素傳遞過程，從而替代原代表皮黑素細胞與角質形成細胞共培養(yǎng)體系，與后者相比本模型具有細胞來源充分、研究周期短、易于重復的優(yōu)點。

值得一提的是，實驗中我們選擇1∶2的黑素細胞與HaCaT接種比例主要是因為HaCaT細胞在KSFM中增殖明顯快于黑素細胞，經3～4天共培養(yǎng)后兩細胞間的比例達到1∶10，基本接近于生理狀態(tài)。另外，本實驗所采用的Fontana-Masson銀染法由于其染色結果不易精細量化評價、敏感性也沒有免疫熒光雙標法強[2,6]，因此只能作為黑素傳遞研究的粗篩試驗。如果借助流式細胞儀則可進一步獲得更為可靠、敏感、精細的評價方法，這將為今后更好的研究黑素傳遞的分子機制、大規(guī)模篩選調節(jié)黑素傳遞的新藥打下良好的基礎。

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[收稿日期]2008-11-06[修回日期]2009-01-08

編輯/張惠娟