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    Foxq1與E-cadherin蛋白在大腸癌中的表達(dá)及其臨床意義

    2014-09-12 08:02:30魏正強(qiáng)蒙長(zhǎng)遠(yuǎn)湯為學(xué)
    中國(guó)老年學(xué)雜志 2014年8期
    關(guān)鍵詞:大腸癌大腸試劑盒

    駱 贊 魏正強(qiáng) 向 相 蒙長(zhǎng)遠(yuǎn) 黎 暉 湯為學(xué)

    (重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸外科, 重慶 400016)

    近年來(lái),隨著生活水平的提高,大腸癌的發(fā)病呈上升趨勢(shì),嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量〔1〕。近幾年有研究報(bào)道,卵巢癌,肺癌,乳腺癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移均與Foxq1的高表達(dá)有關(guān)〔2~4〕。E-cadherin蛋白是上皮間質(zhì)化(EMT)的標(biāo)志之一,其表達(dá)降低與大腸癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移有重要聯(lián)系〔5,6〕。目前,國(guó)內(nèi)外綜合研究二者在大腸癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移的報(bào)道較少,本實(shí)驗(yàn)探討Foxq1和E-cadherin蛋白在大腸癌中的相互作用及其與大腸癌的臨床病理特征的關(guān)系。

    1 資料與方法

    1.1材料 收集重慶醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胃腸外科2012年3~9月行大腸癌根治術(shù)的標(biāo)本62例,每例均包括癌組織、癌旁組織(距癌組織2~5 cm)、正常大腸黏膜組織(距癌旁組織≥8 cm)。所有標(biāo)本均得到病理學(xué)證實(shí),且術(shù)前均未行放化療,所有病例臨床及病理資料完整,其中男36例,女26例,Dukes A或B期34例,C或D期28例,年齡31~83歲,平均(58.3 ±9.43)歲。

    1.2方法

    1.2.1主要試劑 免疫組化SP試劑盒,DAB顯影液購(gòu)自北京康為生物公司;兔抗人Foxq1多克隆抗體購(gòu)自ABGENT公司;兔抗人E-cadherin抗體購(gòu)自Protetech公司;山羊抗兔二抗,凝膠試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司;蛋白提取試劑盒購(gòu)自貝博公司。

    1.2.2免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Foxq1與Ecadherin在大腸癌標(biāo)本中的表達(dá) 上述每例標(biāo)本取一部分行10%中性甲醛固定24 h,梯度酒精脫水,石蠟包埋,4 μm連續(xù)切片。按免疫組織化學(xué)SP法試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,F(xiàn)oxq1和E-cadherin一抗稀釋度為1∶100,用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。經(jīng)DAB顯色,蘇木精復(fù)染后,用Olympus光學(xué)顯微鏡下觀察切片,以出現(xiàn)棕黃色至棕褐色顆粒為染色陽(yáng)性,根據(jù)著色強(qiáng)度和著色面積將染色強(qiáng)度分為4級(jí):0分,細(xì)胞無(wú)顯色;1分,淺黃色;2分,棕黃色;3分,棕褐色。每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)視野,根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的著色面積百分率分為5個(gè)等級(jí):<5%為0級(jí);5%~25%為1級(jí);26%~50%為2級(jí);51%~75%為3級(jí);>75%為4級(jí),分別取相應(yīng)分值0、1、2、3、4分。用細(xì)胞數(shù)得分和強(qiáng)度得分的和作為判斷表達(dá)結(jié)果,積分0~1分為陰性(-),2分為弱陽(yáng)性(+),3~5分為中等陽(yáng)性(),6~7分為強(qiáng)陽(yáng)性()。

    1.2.3Western印跡檢測(cè)Foxq1與E-cadherin在大腸癌標(biāo)本中的表達(dá) 收取新鮮大腸癌標(biāo)本35例保存于-80℃。按照蛋白提取試劑盒操作說(shuō)明提取上述組織的總蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度。取50 μg總蛋白加適量上樣緩沖液,煮沸變性5 min。分別配制5%濃縮膠和10%分離膠,恒壓40 V電泳,待Marker電泳至濃縮膠后調(diào)整電壓至80 V;待Marker電泳至距玻板底部1 cm時(shí)停止電泳。250 mA恒流轉(zhuǎn)印蛋白至0.45 μm PVDF膜上,5%的脫脂奶粉溶液封閉2 h,以兔抗人Foxq1抗體和兔抗人Ecadherin抗體作為一抗(1∶200),4℃孵育過(guò)夜,TBST洗膜3次,15 min/次。再加入羊抗兔二抗(1∶2 000),37℃孵育90 min,洗膜同前。采用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件,免疫組化結(jié)果采用χ2檢驗(yàn);Western印跡結(jié)果采用方差分析;相關(guān)性分析采用Spearman檢驗(yàn)。

    2 結(jié) 果

    2.1Foxq1與Ecadherin在大腸癌標(biāo)本中的表達(dá)

    2.1.1免疫組織化學(xué)結(jié)果 Foxq1蛋白表達(dá)定位于細(xì)胞核,E-cadherin蛋白表達(dá)定位于細(xì)胞膜。Foxq1在大腸癌組織中的表達(dá)水平高于大腸癌癌旁組織及正常大腸黏膜組織,在癌旁組織的表達(dá)水平高于正常組織;其中,在大腸癌組織中的表達(dá)率為75.8%(47/62);在癌旁組織中的表達(dá)率為24.2%(15/62),在正常大腸黏膜組織中僅為6.5%(4/62);差異比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。E-cadherin蛋白在大腸癌組織中的表達(dá)水平明顯低于大腸癌癌旁組織及正常大腸黏膜組織,在癌旁組織的表達(dá)水平低于正常組織;其中,在大腸癌組織中的表達(dá)率為14.5%(9/62),在癌旁組織中的表達(dá)率為30.6%(19/62),在正常大腸黏膜組織中僅為66.1%(41/62),差異比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1、圖2。

    2.1.2Western印跡檢測(cè)結(jié)果 Foxq1在大腸癌組織中表達(dá)水平(0.749±0.297)明顯高于正常大腸黏膜組織(0.189±0.154)及癌旁組織(0.434±0.213),癌旁組織相對(duì)于正常黏膜組織也有所增高。E-cadherin蛋白在大腸癌組織中表達(dá)水平(0.379±0.176)明顯低于正常大腸黏膜組織(0.837±0.284)及癌旁組織(0.628±0.245),癌旁組織相對(duì)于正常黏膜組織也有所降低,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

    2.2Foxq1與E-cadherin蛋白的表達(dá)與大腸癌臨床病理特點(diǎn)之間的關(guān)系 二者在大腸癌中的表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤大小無(wú)關(guān)(P>0.05),而與腫瘤的分化程度、Duke分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表1、表2。

    2.3Foxq1與E-cadherin蛋白在大腸癌中的相關(guān)性 經(jīng)Spearman相關(guān)分析顯示,F(xiàn)oxq1與E-cadherin蛋白在大腸癌中的表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.864,P<0.05;Western印跡r=-0.718,P<0.05)。

    圖1 Foxq1在大腸癌組織中的表達(dá)(SP, ×200)

    圖2 E-cadherin在大腸癌組織中的表達(dá)(SP, ×200)

    1:正常大腸黏膜組織;2:大腸癌旁組織;3:大腸癌組織

    表1 Foxq1、E-cadherin蛋白的陽(yáng)性表達(dá)與大腸癌的臨床病理特征的關(guān)系(n)

    表2 Foxq1、E-cadherin蛋白的表達(dá)與大腸癌的臨床病理特征的關(guān)系

    3 討 論

    Fox家族是一類龐大而功能廣泛的轉(zhuǎn)錄因子家族,參與胚胎發(fā)育、細(xì)胞周期調(diào)控、糖類和脂類代謝、生物老化、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)過(guò)程,其突變和表達(dá)異常與發(fā)育畸形、代謝性疾病以及腫瘤發(fā)生有關(guān)〔7〕。Fox家族中,有多個(gè)亞族都廣泛參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移。FoxMlb在肝細(xì)胞癌〔8〕、乳腺癌〔9〕和基底細(xì)胞癌中均表達(dá)增高。研究表明,F(xiàn)oxM1上調(diào)在食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生中起到了十分關(guān)鍵的作用,而且FoxM1表達(dá)水平越高預(yù)后越差〔10〕。對(duì)于黑色素瘤細(xì)胞的調(diào)控,F(xiàn)oxO3a與FoxP3也起著至關(guān)重要的作用〔11,12〕。此外,還有報(bào)道FoxP1在胃黏膜相關(guān)淋巴組織(MALT)淋巴瘤中高表達(dá)〔13〕,且與乳腺癌的進(jìn)展密切相關(guān)〔14〕。另外,F(xiàn)oxD4a、FoxIMb的表達(dá)與白血病的發(fā)生也有著十分緊密的聯(lián)系。

    Foxq1是Fox基因家族的新發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子之一,其基因定位于6p25.3,全長(zhǎng)2 319 bp,含有1個(gè)外顯子,編碼有403個(gè)氨基酸的蛋白。Foxq1在肺癌的發(fā)生中起到關(guān)鍵性作用,通過(guò)調(diào)控E-cadherin,使其表達(dá)下調(diào),引起肺上皮細(xì)胞發(fā)生EMT化,最終導(dǎo)致肺癌發(fā)生〔4〕。E-cadherin是一種鈣依賴性跨膜糖蛋白,介導(dǎo)細(xì)胞間黏附反應(yīng),被稱為上皮標(biāo)志物。E-cadherin也被公認(rèn)為是一種抑癌因子,其表達(dá)的缺失或下降與多種腫瘤的浸潤(rùn)生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、預(yù)后不良有密切關(guān)系。E-cadherin蛋白在膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、胃癌等惡性腫瘤中均低表達(dá)或不表達(dá)。以上研究證實(shí),由于E-cadherin蛋白的下調(diào)或缺失,可導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)聚集,進(jìn)而激活β-catenin所介導(dǎo)的WNT信號(hào)通路,最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展與轉(zhuǎn)移〔15,16〕。有文獻(xiàn)報(bào)道,F(xiàn)oxq1在乳腺癌中與E-cadherin蛋白的核心啟動(dòng)子區(qū)的E-box結(jié)合,抑制E-cadherin蛋白的表達(dá),從而引起乳腺癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移〔5〕,提示Foxq1和E-cadherin在腫瘤發(fā)生中可能存在一定關(guān)系。

    本研究顯示Foxq1在大腸癌組織中表達(dá)較高,尤其是高惡性程度的和晚期大腸癌,而在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的晚期大腸癌組織中,F(xiàn)oxq1更是明顯表達(dá)增高。而E-cadherin蛋白在大腸癌組織中的表達(dá)明顯降低,尤其是高惡性程度的和晚期大腸癌,而在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的晚期大腸癌組織中,E-cadherin表達(dá)更是明顯表達(dá)減少,提示二者不僅與大腸癌的發(fā)生發(fā)展,還與擴(kuò)散轉(zhuǎn)移有重要聯(lián)系。相關(guān)性分析顯示,F(xiàn)oxq1與E-cadherin蛋白呈負(fù)性相關(guān),提示二者在大腸癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移的過(guò)程中,存在直接或間接的相互調(diào)節(jié)的作用。本研究提示,可能正是由于Foxq1的增加,使E-cadherin蛋白的下調(diào),最終導(dǎo)致大腸癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移,但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

    綜上,揭示了二者在大腸癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移過(guò)程中的相互關(guān)系,F(xiàn)oxq1在大腸癌中處于異?;罨癄顟B(tài),而E-cadherin蛋白在大腸癌明顯低表達(dá),提示二者的聯(lián)合檢測(cè)對(duì)提高大腸癌的診療水平,改善預(yù)后都具有一定意義。同時(shí),也顯示Foxq1可能為大腸癌治療的新靶點(diǎn),可能為臨床化療新藥的開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

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