鎮(zhèn)痛靈在糖尿病防治中的作用機(jī)制

白炳生　劉錦瑤　王　忱　于忠元

【摘要】 目的 研究鎮(zhèn)痛靈對(duì)Wistar糖尿病大鼠的防治作用機(jī)制。方法 3~5個(gè)月齡Wistar鼠75只，雌雄不限，隨機(jī)分為糖尿病組60只，尾靜脈推注1．5%四氧嘧啶50 mg/kg;正常對(duì)照組15只，尾靜脈注射等體積生理鹽水。72 h后，以血糖值大于16．67 mmol/L為造模成功。將糖尿病大鼠隨機(jī)分為4組：①模型組；②3種不同劑量鎮(zhèn)痛靈治療組。第5周測(cè)血糖后乙醚麻醉下斷頭取血，分離血清測(cè)放免、生化指標(biāo)。結(jié)果 ①1型糖尿病模型制備成功;②糖尿病大鼠與正常對(duì)照組比較,血清胰島素(Ins)、C-肽、T-AOC明顯降低，差異有高度顯著性意義(P<0．001);血糖、XO值升高(P<0．001);③中、高劑量治療組血清血清胰島素(Ins)、C-肽、T-AOC值與模型組比較，明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05);血糖、XO值降低(P<0．05)。低劑量治療組各指標(biāo)變化與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0．05)。結(jié)論 鎮(zhèn)痛靈對(duì)糖尿病有防治作用，并在一定劑量范圍內(nèi)呈量效依賴關(guān)系。

【關(guān)鍵詞】大鼠；1型糖尿病；鎮(zhèn)痛靈

Precaution and treatment effects on diabetes mellitus of super painkiller

BAI Bing-sheng,LIU Jing-yao,WANG Chen.Department of Anesthesiology，the Second Hospital of Xiamen，F(xiàn)ujian 361011，China

【Abstract】 Objective To observe and explore the results relation of SuperPainkiller effects experimental the male wistar rats and precaution-treatment of diabetes.Methods 75 wistar rats at 4-6 months of age were divided into two groups at random:The group of diabetes mellitus were 60 rats，they were injected with Alloxan(50 mg/kg1．5%)(2)Control:15 rats were injected with the same dose of sodium chlorido injection.After 72 hours,we observed the blood glucose change，when blood glucose was higher than 16．67 mmol/L,the model was formed，the rats of diabetes mellituswere divided into 4 guoups.(1)The group of diabetes mellitus.(2)the group of diabetes mellituswas treated with super painkiller.After 5 weeks,We tookblood glucose.Got blood from vein，killed the rats，the other side were produced of micture，made serum out，measured dofa.Results (1)I type model of diabetes was formed.(2)Compared diabetes rats with normal group，serum Ins，C-P，T-AOC dropped sharply，the diversity wassignificantly.XO，blood glucose increasd(P<0．001).(3)Compared with the model group， the serum Ins，C-P，T-AOC of therepy(middle、hight)group were very high， the diversity was significantly， XO，blood glucose dropped(P<0．05).low dose group not significantly with diabetes.Conclusion It is proved that super painkiller has surely function of descend blood glucose， it has precaution and treatment function tomalfuction of diabetes rats.

【Key words】Rat;I type diabetes mellitus;Super painkiller

疼痛患者在診斷明確前提下，藥物治療是一種不可缺少的方法。臨床有些鎮(zhèn)痛藥慎用或忌用于糖尿病。鎮(zhèn)痛靈(super paikiller，SP)是由木賊(equisetum hienalel,EHL)和卷柏(selaginella tamanaun sprin,STS)以水醇法制成的一種新型復(fù)方中藥合劑，有活血化瘀、清熱解毒、通經(jīng)活絡(luò)的功效，主要用于慢性疼痛。應(yīng)用鎮(zhèn)痛靈治療疼痛過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)其對(duì)糖尿病有治療作用^[1]。本研究通過(guò)檢測(cè)血糖、胰島素(Ins)、C-P(C-肽)、血清總抗氧化能力(T-AOC)、黃嘌呤氧化酶(XO)等放免、生化相關(guān)指標(biāo)，旨在從分子生物學(xué)角度探討鎮(zhèn)痛靈對(duì)糖尿病大鼠的防治機(jī)制。

1 材料

四氧嘧啶(alloxan，AXN，sigma chemical Co,USA；生產(chǎn)批號(hào)：20050706，粉劑)； Ins、C-P、T-AOC、XO試劑盒(南京建成生物研究所，生產(chǎn)批號(hào)：20050316)；鎮(zhèn)痛靈注射液(烏蘇里江藥業(yè)，生產(chǎn)批號(hào)：20050211，規(guī)格25 mg/ml，2 ml/支)；樂(lè)康血糖儀(美國(guó)羅氏公司)；GL20A全自動(dòng)高速冷凍離心機(jī)(湖南儀表廠)； Wistar大鼠75只，3~5個(gè)月齡，體質(zhì)量215~257 g，中國(guó)醫(yī)大動(dòng)物中心提供。

2 方法與結(jié)果

2．1 糖尿病大鼠模型制備、分組及給藥 將大鼠隨機(jī)分為5組，每組15只：正常對(duì)照組，不干預(yù)；1型糖尿病組，不治療；鎮(zhèn)痛靈低(12．5 mg/kg)、中(25 mg/kg)、高(50 mg/kg)劑量治療組，1次/d，皮下注射。(鎮(zhèn)痛靈注射液按生產(chǎn)規(guī)格25 mg/ml計(jì)算成容積ml數(shù)給藥)；模型制備參考wright法^[2]，血糖值大于16．67 mmol/L為造模成功。 Wistar大鼠禁食16~18 h，自由飲水。60只制造模型鼠尾靜脈1次性注射1．5%AXN 50 mg/kg，正常對(duì)照組尾靜脈推注等體積生理鹽水。

2．2 血液標(biāo)本的采集 每周測(cè)血糖一次。第5周時(shí)各組動(dòng)物乙醚麻醉下斷頭取血，3000轉(zhuǎn)/min離心20 min獲血清，待測(cè)放免、生化指標(biāo)。

2．3 測(cè)定指標(biāo)及方法 放免法檢測(cè)各組鼠血清Ins、C-P、T-AOC、XO濃度和活力，按試劑盒說(shuō)明操作。樂(lè)康血糖儀測(cè)血糖濃度。SPSS 10．0軟件包統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，組間兩均數(shù)比較用t檢驗(yàn)。

2．4 血清中各指標(biāo)見(jiàn)表1。糖尿病大鼠與正常對(duì)照組比較,血清胰島素(Ins)、C-肽、T-AOC明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．01);血糖、XO值升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．01)。(3)中、高劑量治療組血清血清胰島素(Ins)、C-肽、T-AOC值與模型組比較，明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義意義(P<0．05);血糖、XO值降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義意義(P<0．05)。低劑量治療組各指標(biāo)變化與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0．05)。見(jiàn)表1。

3 討論

3．1 關(guān)于1型糖尿病模型 糖尿病是由于持續(xù)性高血糖導(dǎo)致血管、神經(jīng)、內(nèi)分泌的一系列改變，誘發(fā)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與臨床患者出現(xiàn)多系統(tǒng)的并發(fā)癥。

本實(shí)驗(yàn)選用四氧嘧啶(alloxan)性糖尿病動(dòng)物模型，類似人類1型糖尿病。一定量的四氧嘧啶注入大鼠尾靜脈，可以成功復(fù)制1型糖尿病動(dòng)物模型。因四氧嘧啶選擇性破壞胰島B細(xì)胞，使其合成胰島素的功能發(fā)生障礙。胰島細(xì)胞功能異常是糖尿病發(fā)病的基本環(huán)節(jié)。當(dāng)B細(xì)胞不能適應(yīng)環(huán)境變化以維持正常血糖水平時(shí)，血糖升高。持續(xù)高血糖可直接損傷B細(xì)胞，稱為葡萄糖毒性。改善血糖狀況，此毒性作用可有一定程度減輕或消失。

對(duì)葡萄糖反應(yīng)的敏感性是B細(xì)胞維持正常血糖的前提，但長(zhǎng)期高血糖可抑制B細(xì)胞分泌胰島素。當(dāng)組織學(xué)改變后，即使恢復(fù)正常血糖也不能完全逆轉(zhuǎn)已經(jīng)發(fā)生的變化。

四氧嘧啶易溶于水，其溶液不穩(wěn)定，見(jiàn)光易分解成四氧嘧啶酸失效。應(yīng)用時(shí)避光配制保存。研究表明Alloxan致動(dòng)物血糖升高反應(yīng)分為三個(gè)時(shí)相，開(kāi)始血糖升高持續(xù)約2 h，繼而因B細(xì)胞殘存的胰島素釋放出來(lái)引起低血糖約6 h，注射12 h后開(kāi)始持久的高血糖狀態(tài)，保持至72 h為成模。

進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，Wistar大鼠禁食16~18 h后，以1．5%的四氧嘧啶溶液，按50 mg/kg體質(zhì)量尾靜脈一次注射，造模組在72 h后，血糖值均大于等于16．67 mmol/L，符合實(shí)驗(yàn)要求，模型制備成功。用Alloxan制備動(dòng)物糖尿病模型是一種經(jīng)濟(jì)可行的實(shí)驗(yàn)方法，把握實(shí)驗(yàn)條件，成模率高。

3．2 鎮(zhèn)痛靈對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠的防治作用

3．2．1 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)動(dòng)態(tài)檢測(cè)血糖值，首先驗(yàn)證了鎮(zhèn)痛靈的降血糖作用。鎮(zhèn)痛靈治療組在給藥第2周末血糖值明顯低于糖尿病模型組，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，與模型組比較，血糖值下降幅度更大，而與正常對(duì)照組比較，雖血糖值略高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

通過(guò)檢測(cè)血清胰島素、血C肽值，發(fā)現(xiàn)治療組血清胰島素、C肽值明顯高于模型對(duì)照組，而血糖下降值與此呈明顯正相關(guān)，表明鎮(zhèn)痛靈的降血糖作用通過(guò)促進(jìn)胰島素分泌、增加C肽值實(shí)現(xiàn)。四氧嘧啶通過(guò)多種作用機(jī)制損毀、降低胰島B細(xì)胞功能，胰島素分泌減少或無(wú)而引起糖尿病。鎮(zhèn)痛靈具有增加血中胰島素含量的作用，從而推測(cè)其可能作用機(jī)制是鎮(zhèn)痛靈可使殘存的β細(xì)胞功能增強(qiáng)或具有促進(jìn)損傷的B細(xì)胞功能恢復(fù)與胰島組織再生的作用，從而促使B細(xì)胞分泌胰島素和C肽值增加，降低血糖含量，間接對(duì)糖尿病起防治作用。

C肽是胰島素原分子中連接胰島素A鏈與Β鏈的連接肽。胰島素原在蛋白酶作用下裂解產(chǎn)生等分子數(shù)胰島素與C肽^[3]，胰島素與C肽共同儲(chǔ)存在分泌顆粒中，在葡萄糖刺激下同時(shí)分泌入血。凡是能刺激或抑制胰島素分泌的物質(zhì)也同樣能刺激或抑制C肽的分泌。C肽具有輔助胰島素原分子的折疊，參與胰島素A鏈與Β鏈上半胱氨酸間二硫鍵的形成過(guò)程的作用。Ido^[4]發(fā)現(xiàn)C肽在逆轉(zhuǎn)糖尿病血管功能障礙及神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥中與胰島素有很強(qiáng)的協(xié)同效應(yīng)。C肽也能通過(guò)加強(qiáng)胰島素信號(hào)系統(tǒng)功能而增強(qiáng)其降糖效應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，注射ZTL后，治療組Wistar大鼠血清C肽、胰島素值均高于模型對(duì)照組，血糖值接近正常生理濃度。提示ZTL對(duì)C肽和胰島素的分泌有刺激作用，從而對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠有防治作用。

3．2．2 氧自由基與糖尿病 自由基學(xué)說(shuō)是1856年Gamab提出，它主要內(nèi)容是：機(jī)體在正常代謝過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生許多自由基，如細(xì)胞氧化代謝產(chǎn)生超氧陰離子自由基(O₂)等。超氧自由基可以通過(guò)鏈鎖反應(yīng)，生成其他自由基。自由基對(duì)人體危害是方面：分解細(xì)胞外基質(zhì)中的膠質(zhì)及透明質(zhì)酸，使細(xì)胞磷酸骨架的多不飽和脂肪酸氧化，損傷細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和機(jī)能，影響DNA、RNA的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致蛋白質(zhì)氧化呼吸鏈酶失活。從而影響相應(yīng)的蛋白質(zhì)生物學(xué)功能，導(dǎo)致疾病發(fā)生。但機(jī)體在正常情況下存在著抗氧化系統(tǒng)，該防御體系有酶促及非酶促兩部分，代表人體總抗氧化能力，如SOD、GSH-PX、CAT、GST、維生素、氨基酸、金屬蛋白質(zhì)等。這個(gè)體系的防護(hù)氧化作用主要通過(guò)三條途徑：① 分解、清除自由基和活性氧以免引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化;② 分解過(guò)氧化物，阻斷過(guò)氧化鏈;③ 除去起催化作用的金屬離子。防御體各成份之間相互起協(xié)同代償作用。

自上世紀(jì)70年代開(kāi)始對(duì)自由基的研究以來(lái)，自由基對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病的發(fā)生、發(fā)展已得到深入認(rèn)識(shí)。有學(xué)者認(rèn)為四氧嘧啶性糖尿病與自由基有關(guān)。四氧嘧啶進(jìn)入體內(nèi)后，產(chǎn)生大量含氧活性基團(tuán)(O₂、H₂O₂、OH-)等，它們與多價(jià)不飽和脂肪酸發(fā)生氧化反應(yīng)，破壞胰島B細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，使其重要的酶系統(tǒng)失活，抑制核酸及蛋白質(zhì)的合成等。黃嘌呤氧化酶(XO)廣泛分布于體內(nèi)各組織中，黃嘌呤和次黃嘌呤在產(chǎn)生氧自由基反應(yīng)中起催化作用，一定條件下，酶活性增高，氧自由基生成增多。XO活性受多種因素影響，四氧嘧啶進(jìn)入大鼠體內(nèi)后，選擇性損害胰島β細(xì)胞，產(chǎn)生INF-r等多種細(xì)胞因子，誘導(dǎo)XOmRNA 產(chǎn)生，XO合成代謝增強(qiáng)，氧自由基產(chǎn)生增多。

本實(shí)驗(yàn)觀測(cè)到糖尿病模型組大鼠血清XO活力與正常對(duì)照組比較明顯增強(qiáng)，T-AOC降低，與正常對(duì)照組比較,差異有顯著性。Wistar大鼠經(jīng)ZTL治療后，血清T-AOC明顯增高，XO明顯減低，XO、T-AOC與正常對(duì)照組比較，差別無(wú)顯著性意義。這說(shuō)明ZTL可通過(guò)對(duì)抗四氧嘧啶的致脂質(zhì)過(guò)氧化作用，及時(shí)清除體內(nèi)產(chǎn)生的自由基，提高機(jī)體總抗氧化能力，對(duì)糖尿病起防治作用。據(jù)報(bào)道：中藥或天然植物中含有的植物黃酮、鞣酸、酚類和維生素等，可能具有清除自由基、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化作用，提高機(jī)體總抗氧化能力。ZTL中卷柏的主要成分為黃酮，可能是實(shí)現(xiàn)提高抗氧化能力，清除自由基作用的關(guān)鍵因素，此外是否還有其他因素參與尚待進(jìn)一步探討。

本實(shí)驗(yàn)提示，鎮(zhèn)痛靈通過(guò)促進(jìn)胰島素和C肽分泌、清除自由基、提高機(jī)體總抗氧化能力等多種途徑，降低血糖，對(duì)糖尿病起防治作用。

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