多藥耐藥蛋白Ｐ－糖蛋白的研究進(jìn)展

李　?！⌒旌７?/p>

腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐受性是腫瘤治療的主要障礙，也是多數(shù)腫瘤患者預(yù)后不佳的主要原因。有學(xué)者認(rèn)為90%以上惡性腫瘤患者死亡在不同程度上與耐藥因素有關(guān)^[1]。腫瘤產(chǎn)生耐藥與多種因素有關(guān)，如多藥耐藥基因的過(guò)度表達(dá)；谷胱甘肽解毒酶系統(tǒng)活性增高；DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ活性增高或性質(zhì)發(fā)生改變；多藥耐藥相關(guān)蛋白基因表達(dá)增高等。其中由P-糖蛋白介導(dǎo)的多藥耐藥最為重要，本文重點(diǎn)介紹與P-糖蛋白有關(guān)的多種調(diào)控因素及其逆轉(zhuǎn)多藥耐藥（multi resistance,MDR）進(jìn)展。

1 P-糖蛋白的結(jié)構(gòu)與功能

P-糖蛋白又稱P-gp(p-glycoprotein),P-170，是由多藥耐藥基因(MDR1)編碼的分子量為170 KD的糖蛋白，是Biedler于1970年發(fā)現(xiàn)的，Juliano于1976年首次命名的與腫瘤多藥耐藥有關(guān)的一種膜糖蛋白。人MDR1基因的cDNA全長(zhǎng)4669 bp，其中第179~3840 bp之間為一個(gè)開放讀框，起始密碼為ATG，編碼含有1280個(gè)氨基酸殘基的多肽鏈，分子量約為140 KDa。該多膚鏈可以分為兩個(gè)大致相同的同源部分，每部分含有6個(gè)穿膜的ɑ螺旋結(jié)構(gòu)(疏水區(qū))和一個(gè)胞內(nèi)親水結(jié)構(gòu)域。12個(gè)疏水區(qū)在膜內(nèi)排列成6對(duì)，使P-gp多肽鏈嵌于細(xì)胞膜內(nèi)。在胞膜外側(cè)P-gp有3個(gè)N連接的糖基化位點(diǎn)，翻譯后修飾加上去的糖鏈約為30 KDa，使得成熟的P-gp分子量為170 KDa。在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，P-gp的兩個(gè)親水結(jié)構(gòu)域各含一個(gè)ATP結(jié)合位點(diǎn)，分別在第426-433/541-551和1068-1075/1184-1196氨基酸殘基之間^[2]。

關(guān)于P-gp功能單位，有學(xué)者提出“疏水真空清除器”(hydrophobic vacuum cleaner)模式，認(rèn)為P-gp本身形成單一藥物通道，具有藥泵功能，并可在細(xì)胞內(nèi)控測(cè)藥物濃度，當(dāng)藥物進(jìn)入細(xì)胞后，P-gp結(jié)合藥物分子，同時(shí)其ATP位點(diǎn)結(jié)合ATP后釋放能量使藥物轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外，也可以直接從細(xì)胞膜排除藥物，使細(xì)胞內(nèi)藥物濃度始終維持于低水平，細(xì)胞由此獲得耐藥性^[3]。P-gp對(duì)藥物的特異性很小，因此MDR細(xì)胞能對(duì)許多結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同的藥物產(chǎn)生耐藥。這些藥物常具有較大的分子量，多呈脂溶性，能被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞，易與P-gp結(jié)合，如阿霉素、長(zhǎng)春新堿等許多脂溶性抗癌藥。有學(xué)者研究表明鈣調(diào)蛋白抑制劑及其他鈣通道阻滯劑如nicardine可與P-gp結(jié)合，提高藥物的細(xì)胞毒作用。這種作用是由于抑制了藥物的外流，提高了細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度，增加MDR細(xì)胞對(duì)抗癌藥物的敏感性。因此有人推測(cè)，P-gp可能是鈣離子通道的一部分，這也是鈣離子拮抗劑作為化療增敏劑的作用原理。目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為單分子P-gp就是一個(gè)功能單位，而westiein認(rèn)為P-gp在膜內(nèi)是以二聚體和四聚體方式存在的，以形成一個(gè)暢通的藥物通道。

2 P-糖蛋白的分布與調(diào)控

P-gp分布于人的正常肝臟、腎臟和成人的腎上腺、胰腺、結(jié)腸、空腸，在孕婦的子宮分泌上皮腔和人胎盤中也有較高表達(dá)，在CD34+的多能祖干細(xì)胞中也有一定水平的P-gp表達(dá)。MDR1基因的表達(dá)受祖干細(xì)胞分化水平的形響，最原始的造血干細(xì)胞P-gp表達(dá)最高^[4]。這說(shuō)明P-gp并非是一種異常蛋白，它是人體內(nèi)一種具有重要生理功能的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，主要涉及正常組織的解毒、體內(nèi)毒性物質(zhì)的清除、激素的分泌、某些物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)以及參與正常組織細(xì)胞抵御外源性毒素?fù)p傷等。正常人體組織中，P-gp的表達(dá)存在著明顯的個(gè)體差異性，即使是在同一組織中，P-gp的表達(dá)也有明顯的異質(zhì)性。不同組織來(lái)源的腫瘤中P-gp的表達(dá)水平有明顯差別。來(lái)源于MDR1高表達(dá)組織的惡性腫瘤繼續(xù)高表達(dá)MDR1基因，如結(jié)腸癌、腎細(xì)胞癌、肝細(xì)胞癌、腎上腺癌、嗜鉻細(xì)胞瘤，胰腺癌、具有神經(jīng)內(nèi)分泌特征的非小細(xì)胞肺癌等。這些腫瘤在治療前就高表達(dá)P-gp，因此對(duì)抗腫瘤藥物具有天然耐藥性。而許多未經(jīng)治療的腫瘤中mdr1 mRNA和P-gp的表達(dá)水平非常低，甚至不能檢出，這類腫瘤主要包括非小細(xì)胞肺癌、食道癌、胃癌、前列腺癌、肉瘤等。乳腺癌、卵巢癌、非何杰金氏淋巴瘤、兒童急性淋巴細(xì)胞性白血病等開始對(duì)化療藥物敏感，但在化療過(guò)程中或化療結(jié)束后，其P-gp水平常顯著增高而表現(xiàn)出獲得性MDR^[5]。在臨床上，MDR1基因及P-gp的表達(dá)水平可用以判斷腫瘤患者的預(yù)后。

P-gp的表達(dá)受多種因素多種形式的調(diào)控。①通過(guò)MDR1 mRNA和P-gp水平增高，此時(shí)可以沒(méi)有MDR1的擴(kuò)增。Hu^[6]等選擇一株MDR1 mRNA和P-gp低表達(dá)的細(xì)胞系CEM/A7R，接觸柔紅霉素24 h內(nèi)，MDR1 mRNA隨著藥物濃度的增加而遞增，說(shuō)明藥物誘導(dǎo)在MDR的產(chǎn)生中起重要作用；②通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活使MDR1 mRNA表達(dá)增高，P-gp的藥泵功能增強(qiáng)，從而增加細(xì)胞耐藥性，說(shuō)明癌基因通過(guò)MDR1和P-gp使細(xì)胞獲得耐藥性。Chin等實(shí)驗(yàn)表明，Ras基因?qū)DR1啟動(dòng)子有非特異促進(jìn)效應(yīng)，突變型p53有特異促進(jìn)效應(yīng)。癌基因mdm²作為p53基因的拮抗基因，可通過(guò)抑制P53基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄激活功能，而使之失去抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展的能力。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在很少發(fā)生p53基因點(diǎn)突變的惡性腫瘤患者，常有較高比率的mdm2基因的高表達(dá)。mdm2基因可能與MDR1基因的活化有關(guān)^[7]；③通過(guò)翻譯或翻譯后修飾來(lái)增加P-gp的水平，此時(shí)P-gp水平增高是由于P-gp的半衰期延長(zhǎng)所致。P-gp的翻譯后修飾是由于磷酸化作用位置的改變，磷酸化作用水平與P-gp表達(dá)數(shù)量是相關(guān)聯(lián)的。參與P-gp磷酸化作用的酶包括蛋白激酶A(PKA)和蛋白激酶C(PKC)。磷酸化速度越快，P-gp向細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)藥物能力也越強(qiáng)，同時(shí)PKC活性增高，MDR1基因和P-gp過(guò)度表達(dá)。因此，PKC是通過(guò)誘導(dǎo)MDR1基因過(guò)度表達(dá)和加速P-gp的磷酸化而導(dǎo)致MDR的發(fā)生和發(fā)展的。

3 逆轉(zhuǎn)P-糖蛋白的研究進(jìn)展

3．1 單克隆抗體技術(shù)逆轉(zhuǎn)MDR 用P-gp特異性抗體與P-糖蛋白結(jié)合，以抑制其活性及功能，或用單抗連接免疫毒素阻止抗藥性，近來(lái)用P-gp抗體的胞內(nèi)段的可變片段與載體結(jié)合后轉(zhuǎn)染耐藥細(xì)胞可以明顯抑制P-gp的表達(dá)和功能，從而逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的發(fā)生^[8]。

3．2 利用MDR1基因保護(hù)骨髓 若在強(qiáng)力化療之前，將MDR1引入骨髓造血祖細(xì)胞，可以達(dá)到保護(hù)骨髓的作用?；熕幬锏亩拘宰饔弥饕枪撬枰种?，引入MDR1可以使患者接受相對(duì)大劑量的化療，而且可以運(yùn)用較多療程的強(qiáng)力化療，提高治療效果。Hesdorffer^[9]等將多藥耐藥基因逆轉(zhuǎn)錄病毒導(dǎo)入骨髓造血干細(xì)胞，使其對(duì)化療產(chǎn)生耐藥，化療后再回輸體內(nèi)，這樣可解除大劑量化療對(duì)骨髓抑制的不良反應(yīng)，為大劑量化療提供骨髓保護(hù)。

3．3 反義技術(shù)逆轉(zhuǎn)MDR 用人工合成或生物合成的特定互補(bǔ)DNA或RNA片段，轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生的反義核酸與靶mRNA結(jié)合，干擾MDR1DNA的轉(zhuǎn)錄或MDR1RNA的翻譯，從而在翻譯水平特異地抑制MDR1的表達(dá)^[10]。

3．4 細(xì)胞因子的逆轉(zhuǎn)作用 小劑量的a-INF，NTF-a，IL-2對(duì)耐藥結(jié)腸癌細(xì)胞株有逆轉(zhuǎn)作用。這些細(xì)胞因子可降低P-gp表達(dá)，降低其磷酸化程度，還可改變細(xì)胞膜的脂質(zhì)組成和代謝影響P-gp的活動(dòng)，增強(qiáng)化療的敏感性。另外，這些細(xì)胞因子還具有促進(jìn)凋亡的作用，可使受到化療藥物損傷的細(xì)胞來(lái)不及修復(fù)而進(jìn)入凋亡，或是通過(guò)其他途徑直接誘導(dǎo)凋亡而起到逆轉(zhuǎn)耐藥的作用。

3．5 核酶技術(shù)逆轉(zhuǎn)MDR 核酶(ribozmye，Rz)是一類具有生物催化活性的RNA分子。它能夠定點(diǎn)切割mRNA靶分子，從而有效阻斷基因表達(dá)。導(dǎo)入能特異切割靶基因的錘頭狀核酶^[11](hammerhead ribozyme)切割MDR1基因或c-fos基因而逆轉(zhuǎn)耐藥。Chen等^[12]用MDR1核酶導(dǎo)入A549/R對(duì)MDR1 mRNA進(jìn)行剪切，觀察到MDR1的mRNA減少，P-gp表達(dá)下降，細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性增加200倍。Kiehntopf等^[13]選擇靠近起始位點(diǎn)6到4的GUC三聯(lián)碼為Rz識(shí)別、切割的位點(diǎn)，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄法和化學(xué)合成法制備了針對(duì)MDR1 mRNA的Rz，應(yīng)用脂質(zhì)體將Rz基因?qū)肽[瘤細(xì)胞，成功地逆轉(zhuǎn)了腫瘤細(xì)胞的MDR，使腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性增加。

3．6 鈣離子拮抗劑與免疫調(diào)節(jié)劑等MDR逆轉(zhuǎn)劑的運(yùn)用 試驗(yàn)證明鈣離子拮抗劑(如維拉帕米VRP)可提高藥物在耐藥細(xì)胞內(nèi)的積聚^[14]。VRP能與P-gp結(jié)合，抑制P-gp對(duì)細(xì)胞毒藥物的外排。另外VRP還能抑制P-gp的表達(dá)。免疫調(diào)節(jié)劑如環(huán)胞菌素A及其類似物(奎寧類，長(zhǎng)春堿類和蒽環(huán)類)以及利血平等天然產(chǎn)物和多種合成化合物，都與P-gp具有親和力，從而抑制其泵出功能，減少胞內(nèi)藥物排出。

4 P-糖蛋白/MDR1基因檢測(cè)的意義及應(yīng)用

4．1 預(yù)測(cè)患者對(duì)化療藥物敏感性，有針對(duì)性地選擇最有效的化療藥物，避免盲目用藥。

4．2 在化療過(guò)程中，對(duì)MDR1基因表達(dá)進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，若發(fā)現(xiàn)進(jìn)行性增高，提示獲得性多藥耐藥的發(fā)生，應(yīng)根據(jù)情況及時(shí)調(diào)整治療方案。因?qū)嶓w瘤組織不能多次留取，因此臨床現(xiàn)己開展采用外周血或腹水標(biāo)木代替腫瘤組織來(lái)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)其MDR1基因表達(dá)以指導(dǎo)臨床治療^[15]。

4．3 在進(jìn)行化療之前，如觀察到P-gp/MDR1基因呈高表達(dá)，提示患者體內(nèi)存在內(nèi)在性多藥耐藥，可考慮使用逆轉(zhuǎn)MDR的藥物，增加化療藥物的敏感性。

4．4 治療前或治療過(guò)程中，對(duì)MDR1基因進(jìn)行監(jiān)測(cè)，可以預(yù)測(cè)腫瘤對(duì)治療的反應(yīng)、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等轉(zhuǎn)歸。

4．5 在腫瘤化療中通過(guò)MDR1基因?qū)牍撬柙煅杉?xì)胞用于預(yù)防抗癌藥物對(duì)骨髓造血功能的傷害。

4．6 MDR1基因治療 ①M(fèi)DR1載體可用于其他非選擇性基因?qū)朊庖呦到y(tǒng)的細(xì)胞或其他助于治療腫瘤的細(xì)胞如CTL細(xì)胞；②將MDR1基因轉(zhuǎn)染其他類型的細(xì)胞使它合成分泌一些物質(zhì)而減輕腫瘤相關(guān)的并發(fā)癥或減低腫瘤細(xì)胞局部浸潤(rùn)或轉(zhuǎn)移的能力；③MDR1基因可用于修飾腫瘤細(xì)胞木身使其免疫原性增加或促其分泌細(xì)胞因子加強(qiáng)免疫反應(yīng)；④由于造血細(xì)胞表達(dá)P-gp在體內(nèi)具有選擇優(yōu)勢(shì)，這將有助于造血系統(tǒng)疾病的體細(xì)胞基因治療。

參 考 文 獻(xiàn)

［1］ Beauvillain C,Mahe M,Bourdin S,et al.Final results of a randomized trial comparing chemotherapy plus radiotherapy with chemotherapy plus surgery plus radiotherapy in locally advanced resectable by popharyngeal carcinomas.laryngoscope，1997，107:648.

［2］ J Ferte.Analysis of the tangled relationships between P-glycoprotein-mediated multidrug resistance and the lipid phase of the cell membrane.Eur J Biochem，2000,267:277-294.

［3］ RW Johnstone，AARuefli，MJ Smyth.Multiple physiological functions for multidrug transporter P-glycoprotein TIBS,2000,25:1-6.

［4］ Chin KV，Pastan I，CottesmanMM.Functionand regulation of the humanmultidrugresistancegene.Ado Cancer IZes，1993:157-180.

［5］ Hunault M,Zhou D,Delmer A，et al.Multidrug resistance geneexpression in acute myeloid leukemia:major prognosis significance for inviva drug resistance to induction treatment.Ann-Hematol，1997,74 (2):65-71.

［6］ Hu XF，Slater A,Wall DM，et al.Rapid up-regulation of MDR1 expressionby authracyclines in a classical multidrug resistance cell line.Br J cancer， 1995,71(5):931-936.

［7］ Cornwell MM，Smith DE，SPI activates the MDR1 promoter through one of two distinct Grich regions that modulate promoter activity.J Biol chem，1993,268 (26):19505-19511.

［8］ Begrer W，Spiegl-Kreinecker S，Buchroithner J，et al.OverexPression ofthehumanmajorvaultproteininastroyticbraintumor cells.Int J Cancer,2001,94(3):377-382.

［9］ Hesdorffer C，Ayello J，Ward M,et al.Phase I trial of retroviral-mediated transfer of the human MDR1 gene as marrow chemoprotection in patients undergoing high-dose chemotherapy and autologous stem-cell transplantation.J Clin Onco1,1998,16(1):165-172.

［10］ Ramachandran C，Wellham LL.Effect of MDRI phosphorothioate antisense oligodeoxynucleotides in multidrug-resistant human tumor cell lines and xenografts.Anticancer Res，2003，23(3B):2681-2690.

［11］ Wang H，Chen XP，Qiu FZ.Overcoming multi-drug resistance byanti-mdrlribozyme.World J Gastroenterol,2003，9(7):1444-1449.

［12］ ChenL，LiuY.Reversion of multidrug resistance in vitro of lung adenocarcinoma by MDR1 ribozyme.Zhonghua Zhong Liu Za Zhi，2000,22(3):189-191.

［13］ Kiehntopf M，Herrmann F，Brach MA.Functional NF-IL6/CCAAT enhancer-binding protein is required for tumor necrosis factor α-inducible expression of the granulocyte colony-stimulating factor (CSF)，but not the granulocyte/macrophage CSF or interleukin 6 gene in human fibroblasts.J Exp Med,1995,181(2):793-798.

［14］ Mayer LD，Lim KT，Hartley D.Identification of two distinct intracellular sites that contribute to the modulation of multidrug resistance in P388/ADR cells expressing P-glycoprotein.J Exp Ther Oncol，2002，2(2):107-120.

［15］ 白符，隋麗華，婁閣.用外周血、腹水代替卵巢癌組織檢測(cè)MDR1可行性研究.中國(guó)腫瘤臨床，2001，28(l):18-20.