大鼠急性心肌梗死動(dòng)物模型的建立和評(píng)估

雷　娟　伍　衛(wèi)　薛聲能　鄭韶欣

【摘要】 目的 建立一種穩(wěn)定可重復(fù)的大鼠急性心肌梗死模型。方法 SD大鼠經(jīng)氯胺酮麻醉后，經(jīng)口人工呼吸，開胸結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支。4周后行超聲心動(dòng)圖、血流動(dòng)力學(xué)和組織病理學(xué)檢查。結(jié)果 ①心電圖和組織病理學(xué)檢查證實(shí)，成功建立了大鼠急性心肌梗死模型，梗死面積40%~45%（平均42%）；②與假手術(shù)組比較，心肌梗死大鼠左室收縮末徑、左室舒張末徑和非梗死區(qū)增厚指數(shù)明顯增加（P<0．01），左室后壁、左室前壁、梗死區(qū)變薄指數(shù)、左室射血分?jǐn)?shù)和左室短軸縮短率顯著降低（P<0．05，P<0．01）；③心肌梗死大鼠動(dòng)脈收縮壓、舒張壓、左室收縮壓、左室內(nèi)壓最大上升和下降速率均低于假手術(shù)組（P<0．01），心率和左心室舒張末壓高于假手術(shù)組（P<0．01）；④兩組大鼠左、右心室實(shí)際和相對(duì)重量以及膠原容積積分之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0．01）。結(jié)論 本文建立心肌梗死動(dòng)物模型的方法操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、結(jié)果可信。

【關(guān)鍵詞】 冠狀動(dòng)脈；心肌梗死；模型動(dòng)物；大鼠

お

Establishment and assessment of a rat experimental model of acute myocardial infarction

LEI Juan，WU Wei，XUE Sheng-neng，et al.Department of Cardiology，the Second Affiliated Hospital，Sun Yat-sen University，Guangzhou City Guangdong 510120，China

【Abstract】 Objective To develop a steady and reproducible myocardial infarction(MI) model in rats.Methods SD rats were anaesthetized with ketamine.After linking with respiration machine，left anterior decending coronary artery was ligated.Echocardiogram，haemodynamics and histopathology were done four weeks after ligation.Results ①The model of MI was established successfully and proved by electrocardiogram and histopathology.Infarct sizes were 40%~45%(average 42%).②Compared with sham operation group，MI rats had higher left ventricular systolic diameter，left ventricular diastolic diameter and non-infarcted region thickening index (P<0．01)，and lower posterior wall diameter，anterior wall diameter，infarcted region thinningz index，left ventricular ejection fraction and fractional shortening (P<0．05，P<0．01).③Systolic blood pressure，diastolic blood pressure，left ventricular systolic pressure and the maximum rising and dropping rates of left ventricular pressure decreased，while heart rate and left ventricular end-diastolic pressure increased after MI.④There were significant differences in left ventricular actual weight，right ventricular actual weight，left ventricular relative weight，right ventricular relative weight and collagen volume fraction between sham operation group and MI rats (P<0．01).Conclusion This experiment provided an easy way to establich the MI model，which was reproducible and credible.

【Key words】 Coronary artery;Myocardial infarction;Modelanimal;Rats

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是21世紀(jì)醫(yī)學(xué)亟待解決的難題之一^[1]。由于MI的許多病理生理資料難以從臨床研究中獲得，其防治上的進(jìn)展有賴于基礎(chǔ)研究上的突破。MI動(dòng)物模型的建立是開展基礎(chǔ)研究的第一步，它對(duì)于研究人類MI的病理生理變化、心電生理改變以及評(píng)價(jià)各種治療方法具有重大價(jià)值。結(jié)扎左前降支制作MI模型，是一個(gè)被廣泛接受近于成熟的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀５S著實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，它的一些操作步驟、評(píng)價(jià)指標(biāo)等方面仍需進(jìn)一步改進(jìn)。本實(shí)驗(yàn)在傳統(tǒng)方法的基礎(chǔ)上作了相應(yīng)的改進(jìn)，以SD大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象建立MI動(dòng)物模型，方法操作簡(jiǎn)單、模型成功率高、重復(fù)性好，為下一步的實(shí)驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)。

1 對(duì)象與方法

1．1 研究對(duì)象 清潔級(jí)雄性Spreague-Dawley（SD）大鼠20只，體質(zhì)量250~300 g（275±15．3）g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為假手術(shù)組和心肌梗死組。

1．2 研究方法

1．2．1 MI模型的建立^[2-3]氯胺酮（75 mg/kg）腹腔注射麻醉，經(jīng)口人工呼吸（導(dǎo)管置于大鼠的舌體與上頜之間），連接小動(dòng)物呼吸機(jī)予以正壓通氣，潮氣量3~5 ml/100 g，呼吸頻率60次/min，吸呼比1C∶C1。左側(cè)胸部備皮，消毒手術(shù)區(qū)域，經(jīng)胸骨左緣第4肋間開胸，鈍性分離肌肉，以眼科開瞼器撐開肋間肌切口，暴露心臟，剪開心包，于肺動(dòng)脈圓錐與左心耳之間距主動(dòng)脈根部2~3 mm處，用7-0眼科無創(chuàng)縫合針，穿過前降支深部連同一小束心肌一并結(jié)扎。根據(jù)心電圖和心肌組織顏色確定冠脈結(jié)扎成功。逐層縫合胸壁，自主呼吸恢復(fù)后拔出通氣導(dǎo)管。大鼠清醒后送動(dòng)物房飼養(yǎng)，規(guī)律照明，自由進(jìn)食和飲水。術(shù)后連續(xù)3 d予以青霉素40萬U腹腔注射以預(yù)防感染。假手術(shù)對(duì)照組除不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈外，其余步驟相同。

1．2．2 超聲心動(dòng)圖檢查^[4]3%戊巴比妥鈉（45 mg/kg）腹腔注射麻醉，用Philips Sonos 5500型多功能超聲診斷儀（S12探頭，頻率5~12 MHz），在胸骨旁以二維超聲和M型超聲測(cè)量左室收縮末徑（LVSd）、左室舒張末徑（LVDd）、舒張期左室后壁厚度（PWd）、舒張期左室前壁厚度（AWd，MI組為梗死區(qū)室壁厚度）、左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）和短軸縮短率（FS），分別計(jì)算梗死區(qū)變薄指數(shù)（BBZS，即舒張期左室前壁厚度/后壁厚度）和非梗死區(qū)增厚指數(shù)（ZHZS，即舒張期左室后壁厚度/前壁厚度）。所有參數(shù)均在3個(gè)連續(xù)的心動(dòng)周期中進(jìn)行測(cè)量并取平均值。

1．2．3 血流動(dòng)力學(xué)檢查^[5]3%戊巴比妥鈉（45 mg/kg）腹腔注射麻醉，氣管切開插管，保持呼吸道通暢。分離右側(cè)頸總動(dòng)脈，插入2F聚乙烯導(dǎo)管，0．3%肝素生理鹽水抗凝，將壓力傳感器與BL-420E生物信號(hào)采集與處理系統(tǒng)連接，測(cè)量并記錄頸總動(dòng)脈收縮壓（SBP）和舒張壓（DBP），向前推送導(dǎo)管至左心室測(cè)量左室收縮壓（LVSP）、左室舒張末壓（LVEDP）、左室內(nèi)壓最大上升和下降速率（±dp/dt_max）等參數(shù)。

1．2．4 組織病理學(xué)檢查 各項(xiàng)檢查完成后，經(jīng)股靜脈注入10%KCl 2 ml，使心臟停搏于舒張期，迅速取出心臟，PBS液洗去血液，濾紙洗凈水分后用電子天平（精確到0．1 mg）分別稱取左、右心室實(shí)際重量（LVAW、RVAW），計(jì)算其與體質(zhì)量（BW）的比值，得到左、右心室相對(duì)重量（LVRW、RVRW）。將心臟從心尖到心底沿長(zhǎng)軸橫切4等分，4%多聚甲醛固定24 h后分別石蠟包埋。各取一張5 μm的病理切片作HE染色。用HPIAS彩色病理圖文分析系統(tǒng)測(cè)量每張切片的心內(nèi)膜緣總長(zhǎng)及心梗部位心內(nèi)膜緣長(zhǎng)度，計(jì)算梗死面積^[6]。組織切片常規(guī)Masson染色，隨機(jī)選取4個(gè)不含血管視野，用Image Pro Plus5．0圖像分析軟件計(jì)算膠原容積積分（collagen volume fraction，CVF）^[7]。

1．2．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，以P<0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 大鼠生存情況 MI組大鼠14只，術(shù)中死于心室顫動(dòng)和心跳呼吸驟停4只，術(shù)后1周死亡1只（心力衰竭），存活4周大鼠共9只，存活率為64．3%。6只假手術(shù)組大鼠全部存活。

2．2 MI復(fù)制成功的證據(jù)

2．2．1 大鼠一般情況 冠脈結(jié)扎術(shù)后大鼠精神萎靡呈蜷縮狀、活動(dòng)較少、呼吸淺促、抓起時(shí)反抗較輕，毛發(fā)枯槁呈黃白色、多見倒豎，進(jìn)食量明顯減少；同期假手術(shù)組大鼠術(shù)后1 d即恢復(fù)至術(shù)前的食欲和運(yùn)動(dòng)量，毛發(fā)平滑而有光澤。

2．2．2 心電圖 冠脈結(jié)扎即刻，縫線下方心肌色澤變白，局部心肌運(yùn)動(dòng)減弱，心電圖提示肢導(dǎo)聯(lián)R波振幅明顯升高，ST段弓背向上抬高0．2 mV以上。結(jié)果見圖1。

2．2．3 心肌組織HE染色 假手術(shù)大鼠心肌細(xì)胞橫紋及閏盤清晰，纖維結(jié)構(gòu)清楚、排列整齊、無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；冠脈結(jié)扎術(shù)后4周非梗死區(qū)心肌細(xì)胞代償性肥大，纖維組織增生、排列紊亂、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，部分心肌細(xì)胞肌漿嗜伊紅性增強(qiáng)。結(jié)果見圖2。測(cè)量所得MI組大鼠的梗死面積在40%~45%之間（平均42%）。

2．2．4 心肌組織Masson染色 假手術(shù)組心肌組織膠原纖維少，無條索狀及融合的膠原纖維；MI組左室非梗死區(qū)膠原纖維顯著增多，呈條索狀，分割包繞心肌束、部分膠原纖維融合。結(jié)果見圖3。

2．3 超聲心動(dòng)圖檢查 與假手術(shù)組比較，MI大鼠LVSd、LVDd和ZHZS明顯增加（P<0．01），PWd、AWd、BBZS、LVEF和FS明顯降低（P<0．05，P<0．01），結(jié)果見表1。

2．4 血流動(dòng)力學(xué)檢查 與假手術(shù)組比較，MI大鼠SBP、DBP、LVSP、±dp/dt_max均顯著降低（P<0．01），HR和LVEDP顯著增加（P<0．01），結(jié)果見表2。

2．5 心室重構(gòu)指標(biāo) 與假手術(shù)組比較，MI大鼠左、右心室實(shí)際和相對(duì)重量以及CVF均明顯增加（P<0．01），結(jié)果見表3。

3 討論

MI動(dòng)物模型的制作有多種方法，各有利弊，也因人而異。早期國(guó)外多采用Johns法^[8]，即在自主呼吸條件下，不用呼吸機(jī)支持，迅速開胸?cái)D出心臟行冠狀動(dòng)脈結(jié)扎。這種方法需要在極短的時(shí)間內(nèi)完成操作，技術(shù)要求高，難度大，難以掌握；而且由于心臟移位，容易導(dǎo)致血流動(dòng)力學(xué)紊亂和心律失常等并發(fā)癥；開胸后小動(dòng)物呼吸無法得到保證，因而手術(shù)死亡率極高。此后Fisbein^[9]和Pfeffer^[10]在Johns法的基礎(chǔ)上略加改進(jìn)，應(yīng)用小動(dòng)物呼吸機(jī)維持呼吸，明顯提高了手術(shù)的成活率。目前常用的氣道建立方法有：氣管切開、經(jīng)口氣管插管、經(jīng)口人工呼吸（導(dǎo)管置于大鼠的舌體與上頜之間）、面罩呼吸等。氣管切開法雖然操作容易，但術(shù)后呼吸道并發(fā)癥多，大鼠難以長(zhǎng)期存活。經(jīng)口氣管插管相對(duì)較難，技巧性大，需要有麻醉插管經(jīng)驗(yàn)，如果不熟練，一次插管不成功，反復(fù)操作刺激大鼠喉部，易使其喉部粘膜水腫，氣道分泌物增加，導(dǎo)致氣道阻塞甚至窒息死亡^[11]。

本實(shí)驗(yàn)在小動(dòng)物呼吸機(jī)支持下，經(jīng)口人工呼吸（導(dǎo)管置于大鼠的舌體與上頜之間），操作簡(jiǎn)便，且可在開胸后為冠狀動(dòng)脈結(jié)扎贏得較長(zhǎng)時(shí)間，術(shù)后呼吸道并發(fā)癥少。經(jīng)口人工呼吸中，氣體經(jīng)口腔進(jìn)入胃腸是常見的問題，但不影響動(dòng)物存活。人工呼吸前采用小腹帶繃扎腹部，可明顯減少氣體進(jìn)入胃腸。與此同時(shí)本實(shí)驗(yàn)以眼科開瞼器充分撐開肋間肌切口，不但手術(shù)視野清晰，易于操作，而且避免心臟移位和血流動(dòng)力學(xué)紊亂，明顯減小心臟損傷和心律失常等的發(fā)生。準(zhǔn)確結(jié)扎是MI模型制作成功的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)以左心耳和肺動(dòng)脈圓錐為標(biāo)志，在距主動(dòng)脈根部2~3 mm處結(jié)扎冠狀動(dòng)脈，定位準(zhǔn)確，重復(fù)性好。熟練后從開胸至縫合整個(gè)過程可在1 min內(nèi)完成，結(jié)扎成功率高，術(shù)后存活率也高。造模4周后，大鼠心臟左室前壁可見瘢痕組織，超聲心動(dòng)圖示梗死區(qū)心肌運(yùn)動(dòng)減弱，非梗死區(qū)心肌、室間膈和右室明顯肥厚，左室腔擴(kuò)張。HE染色和Masson染色示非梗死區(qū)纖維組織增生、排列紊亂、伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。血流動(dòng)力學(xué)檢查示左室收縮和舒張功能下降。提示MI動(dòng)物模型建立成功。試驗(yàn)中MI組各大鼠的梗死面積在40%~45%之間（平均42%），表明實(shí)驗(yàn)均一性良好。

MI模型制備過程中存在麻醉、氣道建立、呼吸機(jī)參數(shù)調(diào)節(jié)、冠狀動(dòng)脈結(jié)扎等易導(dǎo)致造模失敗或大鼠死亡的因素。為了提高模型制造的成功率及大鼠的存活率，本實(shí)驗(yàn)注意做到以下幾點(diǎn)，供讀者參考：①嚴(yán)格稱重，準(zhǔn)確計(jì)算麻醉藥量；②術(shù)中保證良好的人工呼吸；③正確選擇開胸位置，以眼科開瞼器充分暴露胸腔，使手術(shù)視野清晰；④結(jié)扎部位準(zhǔn)確，進(jìn)針深度適當(dāng)；⑤術(shù)中避免肺損傷，術(shù)后恢復(fù)胸腔負(fù)壓；⑥盡量縮短手術(shù)時(shí)間；⑦良好的術(shù)后保暖和護(hù)理；⑧術(shù)后嚴(yán)密觀察及時(shí)處理嚴(yán)重的心律失常。

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