具有多向分化潛能的脂肪干細(xì)胞研究的新進(jìn)展

王剛 曹衛(wèi)剛

具有多向分化潛能的脂肪干細(xì)胞研究的新進(jìn)展

王剛 曹衛(wèi)剛

Friedenstein等[1-2]首先發(fā)現(xiàn)骨髓源性干細(xì)胞并肯定了其多向分化潛能，隨后又在人體其他組織中發(fā)現(xiàn)類似的細(xì)胞。Caplan[3]首先提出，間充質(zhì)干細(xì)胞是機體中一小部分具有增殖分化能力的細(xì)胞，可以向特定細(xì)胞系分化并構(gòu)建該特定組織。在胚胎期，該細(xì)胞可參與骨與軟骨等組織的構(gòu)建；在成體內(nèi)，可參與組織的更新。與造血干細(xì)胞不同的是，該細(xì)胞具有向多個胚層細(xì)胞系分化的能力，在組織工程化組織構(gòu)建中可以作為種子細(xì)胞，骨髓中的間充質(zhì)干細(xì)胞就是目前應(yīng)用最多的種子細(xì)胞。然而，抽取骨髓會給患者帶來痛苦，獲得的細(xì)胞也不多。Zuk等[4]首先發(fā)現(xiàn)的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（Adipose-Derived Stem Cells，ADSC）能夠分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、血管內(nèi)皮、肝、胰、神經(jīng)等細(xì)胞系類型，具有易獲得、易擴增、不易衰老等特點，這使其在細(xì)胞或基因治療中有可能發(fā)揮重要作用。本文就ADSC的生物學(xué)特點與多向分化能力進(jìn)行綜述。

1 ADSC的特點

Traktuev等[5]發(fā)現(xiàn)ADSC主要集中于脂肪組織的血管周圍，與血管內(nèi)皮細(xì)胞一樣都可以分泌細(xì)胞因子，保持了彼此在結(jié)構(gòu)與功能上的穩(wěn)定。同時，從脂肪抽吸物中分離ADSC，就混雜入其他的細(xì)胞，如血管平滑肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等，經(jīng)過分離培養(yǎng)后，貼附在培養(yǎng)皿底部、形似成纖維細(xì)胞且經(jīng)多代培養(yǎng)不易衰老的細(xì)胞，即ADSC。但是，其中是否會摻雜隨血液而來的骨髓干細(xì)胞（Bone Marrow Stem Cells，BMSC），尚需進(jìn)一步探討[6]。

ADSC的獲取量和和分化能力受供者年齡、取材部位與手術(shù)方式的影響。年齡影響ADSC的增生能力，供者的年齡越小，細(xì)胞的增生能力越好；不同部位的ADSC凋亡的傾向不同，如腹部的ADSC不容易凋亡[7-8]；脂肪抽吸手術(shù)不會影響ADSC的活性，只是吸管的粗細(xì)會影響脂肪顆粒的大小，進(jìn)而影響分離的難易程度，但在超聲輔助下抽脂獲取的ADSC增生能力降低[9]。

ADSC的免疫標(biāo)志隨著不斷傳代會發(fā)生變化。其中，間充質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志CD13、CD29、CD44、CD63、CD73、CD90、CD166等起初表達(dá)低，但隨著不斷的傳代其表達(dá)顯著增加；而干細(xì)胞相關(guān)表面標(biāo)志CD34的表達(dá)一直很高。如果能用這些標(biāo)志對ADSC進(jìn)行有效分選，可以得到較純的ADSC，將有助于對ADSC的進(jìn)一步研究[10]。

A DSC也具有分泌功能，會分泌促進(jìn)血管生成的相關(guān)因子，如血管內(nèi)皮生長因子、粒細(xì)胞集落刺激因子、間質(zhì)源性因子-1α、肝細(xì)胞生長因子，以促進(jìn)血管再生[11]。ADSC也能通過旁分泌作用于成纖維細(xì)胞，促進(jìn)其分泌Ⅰ、Ⅲ型膠原和纖連蛋白，促進(jìn)皮膚表皮細(xì)胞的成熟以利于創(chuàng)面愈合和瘢痕縮小[12]；ADSC分泌的前列腺素E2具有抑制細(xì)胞免疫反應(yīng)，降低ADSC免疫原性[13]。ADSC能夠適應(yīng)多種情況，在低糖低氧低谷氨酸等極端情況下仍能保持活性，但是分化能力降低[14]。

2 ADSC具有多向分化潛能

ADSC在一系列化學(xué)物質(zhì)與細(xì)胞因子的作用下可以分化為不同的細(xì)胞，包括脂肪、骨、軟骨、心肌、平滑肌、骨骼肌、肝、胰、血管內(nèi)皮、上皮組織及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞等，也可以用作基因治療的載體，甚至能應(yīng)用于血液病的治療，這顯示ADSC在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有潛在的巨大的應(yīng)用前景。

2.1 向脂肪分化

ADSC在體外擴增以后，加入誘導(dǎo)液（含異丁基甲基黃嘌呤、吲哚美辛、地塞米松等）后可向脂肪分化，2周左右，經(jīng)油紅染色與熒光染色后可觀察到分化成熟的脂肪細(xì)胞[15]。細(xì)胞在傳代過程中會發(fā)生變化，Wall等[16]通過測定細(xì)胞內(nèi)的脂蛋白脂肪酶和過氧化質(zhì)體增殖物激活受體γ2（P eroxisome proliferator-activated receptor gamma2，PPARgamma2）的基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的量與細(xì)胞內(nèi)的脂肪滴，發(fā)現(xiàn)在10代以內(nèi)，向脂肪分化的細(xì)胞還可以向骨分化，但10代以后細(xì)胞向脂肪分化的可能性減小，主要向骨分化。

Kakudo等[17]先用成纖維生長因子2（Fibroblast growth factor 2，F(xiàn)GF2）預(yù)處理ADSC，然后向脂肪誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)參與脂肪生成的重要的轉(zhuǎn)錄因子PPARgamma2的mRNA表達(dá)上調(diào)，ADSC向脂肪分化的能力增強。另有報道發(fā)現(xiàn)，感染了人腺病毒Ad-36的ADSC可以向脂肪分化，即使在向骨細(xì)胞誘導(dǎo)的培養(yǎng)液里或在沒有誘導(dǎo)劑的情況下，隨著培養(yǎng)時間的延長和病毒劑量的增加，ADSC在脂肪分化時所產(chǎn)生的特異性的物質(zhì)（如PPARgamma2、脂肪酸結(jié)合蛋白）也增加，同時細(xì)胞內(nèi)脂肪滴增加，其向脂肪分化的能力顯著增強[18]。

2.2 向骨的分化

ADSC通常在地塞米松、甘油三磷酸與抗壞血酸磷酸酯的誘導(dǎo)下可以向骨細(xì)胞分化，經(jīng)茜素紅染色后可以觀察到分化形成的骨細(xì)胞。Hanson等[19]發(fā)現(xiàn)，ADSC在培養(yǎng)中如果受到持續(xù)或間接的拉伸等物理刺激，其成骨能力顯著增強。Al-Salleeh等[20]用骨形成蛋白-1（Osteogenic protein－1，OP1）誘導(dǎo)ADSC分化，21 d后，發(fā)現(xiàn)實驗組形成了鈣化結(jié)節(jié)的能力且成骨能力強于對照組。也有研究認(rèn)為，骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（Bone morphogenetic protein，BMP2）可以誘導(dǎo)ADSC向骨分化，但是，Grewal等[21]等發(fā)現(xiàn)把BMP2加到培養(yǎng)液后，向骨分化的關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄因子Cbfa-1減少，細(xì)胞表面的BMP2受體減少且細(xì)胞分泌胞外蛋白基質(zhì)的能力降低，同時用含有BMP2而不含有ADSC的PLGA材料同樣可以修復(fù)兔子的股骨缺損。BMP2是否可以誘導(dǎo)ADSC向骨細(xì)胞分化，是存在爭議的。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞生長因子的配體與受體可以調(diào)節(jié)ADSC向骨分化的能力[22]。

脂肪的來源部位與供者性別對ADSC向骨細(xì)胞的分化能力也有影響。來源于男性的淺層脂肪的細(xì)胞向骨分化能力強，表現(xiàn)為分化早、速度快、成功率高；女性的雌激素水平可影響ADSC的分化能力，雌激素水平高則ADSC向脂肪分化的能力強[23]。

2.3 向軟骨的分化

ADSC在含有高濃度的葡萄糖、骨形態(tài)發(fā)生蛋白6、轉(zhuǎn)化生長因子β3、地塞米松、抗壞血酸磷酸酯、脯氨酸、丙酮酸、胰島素、牛血清蛋白、亞油酸等的培養(yǎng)基的誘導(dǎo)下，可以向軟骨分化。Jin等[24]用腺病毒介導(dǎo)的人轉(zhuǎn)化生長因子β2的基因轉(zhuǎn)染ADSC，可以使細(xì)胞向軟骨分化。Xu等[25]發(fā)現(xiàn)具有立體結(jié)構(gòu)的種植材料，不僅有良好的力學(xué)性能，還有利于細(xì)胞間的信息交流，有利于細(xì)胞向軟骨的分化。

ADSC是否適合作為種子細(xì)胞來誘導(dǎo)軟骨分化，尚存爭議。Cui等[26]應(yīng)用ADSC－PLGA復(fù)合物來修復(fù)關(guān)節(jié)非負(fù)重部位的軟骨缺損獲得成功，證明了ADSC可以用于軟骨的修復(fù)，但其生物學(xué)性能是否可以長期滿足活體的功能尚有待于進(jìn)一步研究。

2.4 向內(nèi)皮的分化

在胚胎期，部分來自中胚層的細(xì)胞分化為內(nèi)皮祖細(xì)胞，這些細(xì)胞聚集成群，融合形成了胚胎期初級微血管叢。經(jīng)進(jìn)一步發(fā)育，胚胎的動靜脈與微血管系統(tǒng)形成，血液循環(huán)系統(tǒng)建立起來。在成體內(nèi)，隨血液流動的內(nèi)皮祖細(xì)胞也參與了血管的生成，在血管構(gòu)建過程中起了重要作用。淋巴內(nèi)皮細(xì)胞起源于胚胎靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，由靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷徙構(gòu)建淋巴囊，而后經(jīng)過出芽、分支、增生、分化與重建，形成淋巴管系統(tǒng)。在分子水平，由Dll4（Delta-like-4 ligand）或JAG1（Jagged1）引發(fā)的Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)控制了血管內(nèi)皮的出芽增生，而轉(zhuǎn)錄因子FOXC1和FOXC2可以增加Notch途徑中Dll4配體的表達(dá)，從而加快了Notch信號途徑，VEGFa也可以作用于Notch信號途徑；同時，VEGFa作用于VEGFR2或Neuropilin-1，引發(fā)了編碼動脈標(biāo)志性蛋白Ephrin-B2的基因表達(dá)，配體Ephrin-B2與相應(yīng)因子結(jié)合后，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞間的連接及細(xì)胞與基質(zhì)的黏附。在靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中，由于存在核受體COUP-TFII，Notch信號途徑被抑制，但有利于靜脈內(nèi)皮特異性蛋白EphB4的表達(dá)。當(dāng)胚胎靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)PROX1（Prospero-related homeobox-1 transcription factor）開始表達(dá)時，標(biāo)志著淋巴內(nèi)皮的誕生。此外，酪氨酸激酶和轉(zhuǎn)接蛋白SLP-76也可以用來區(qū)分血管與淋巴管內(nèi)皮。淋巴管囊形成過程中，VEGFR3在Neuropilin-2的協(xié)助下可以調(diào)節(jié)整個過程，而參與調(diào)節(jié)分化最后階段的因子還有Forkhead box轉(zhuǎn)錄因子、唾液酸糖蛋白Podoplanin、配體Ephrin-B2和Angiopoietin-2，這些因子的改變都會影響淋巴系統(tǒng)的功能[27]。

在由血管內(nèi)皮向淋巴內(nèi)皮的分化過程中，PROX1基因產(chǎn)物通過多種信號途徑的連鎖反應(yīng)在誘導(dǎo)分化中起主導(dǎo)作用。例如,它可以上調(diào)編碼Integrinα9的基因的表達(dá)，而Integrin α9可以改變細(xì)胞形態(tài)，抑制內(nèi)皮形成管壁，刺激細(xì)胞開始遷移；同時PROX1可以增強VEGFR3的表達(dá)，此受體可以與VEGFC與VEGFD（淋巴內(nèi)皮的特異生長因子）特異性的結(jié)合，可以使內(nèi)皮細(xì)胞趨向VEGFC和VEGFD，Integrinα9也具有類似的作用；PROX1可以抑制VEGFR2的表達(dá)，該受體與VEGFA特異性結(jié)合，是與血管內(nèi)皮相關(guān)的[28]。

研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞可以分化為內(nèi)皮細(xì)胞。Silva等[29]將提取的BMSC注入到狗的心肌缺血損傷部位，發(fā)現(xiàn)BMSC可以分化為血管內(nèi)皮及血管平滑肌細(xì)胞，分泌Ⅷ因子，并通過血管內(nèi)皮生長因子等旁分泌機制促進(jìn)血管的再生，結(jié)果損傷部位血管密度增加，無免疫排斥，這使BMSC有可能應(yīng)用于心肌損傷的干細(xì)胞治療，提示缺血缺氧的環(huán)境有可能促進(jìn)BMSC分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞。通過測定動物模型左心室的射血分?jǐn)?shù)，發(fā)現(xiàn)移植BMSC后心臟功能改善。Conrad等[30]證明了間充質(zhì)干細(xì)胞可以被誘導(dǎo)獲得淋巴內(nèi)皮細(xì)胞表型并在活體內(nèi)重建淋巴管。他們提取鼠的BMSC，用培養(yǎng)微血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)液的上清液、淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液的上清液與純化的血管內(nèi)皮生長因子誘導(dǎo)分化，間充質(zhì)干細(xì)胞表現(xiàn)出淋巴內(nèi)皮細(xì)胞的表型及向VEGFC的趨化性。鼠淋巴水腫模型在移植誘導(dǎo)過的BMSC后，病灶區(qū)有淋巴管結(jié)構(gòu)的重建，水腫減輕。

ADSC與BMSC同樣具有向內(nèi)皮分化的能力。Cao等[31]從脂肪組織提取的細(xì)胞中分選到CD31、CD34陰性的細(xì)胞，并培養(yǎng)在含有VEGF與FGFb等生長因子的培養(yǎng)液中，可以發(fā)現(xiàn)管樣結(jié)構(gòu)形成，內(nèi)皮細(xì)胞表型表達(dá)陽性，具有典型的內(nèi)皮細(xì)胞吞噬功能。將其移植到裸鼠缺血損傷部位，2周后發(fā)現(xiàn)組織灌注改善，新生的血管內(nèi)皮均由ADSC分化組成。

2.5 向肌肉的分化

ADSC在白介素3、白介素6等細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下可以向心肌細(xì)胞分化。將經(jīng)誘導(dǎo)的ADSC移植到心肌損傷部位，ADSC可以分化為心肌細(xì)胞，修復(fù)變薄的心肌，還可以通過旁分泌機制促進(jìn)損傷部位血管再生，改善心功能[32]。在特殊誘導(dǎo)劑的作用下，ADSC也可以向骨骼肌細(xì)胞分化，與骨骼肌細(xì)胞共培養(yǎng)，可以增強它向骨骼肌的分化能力。但是，傳代以后的ADSC需要在與骨骼肌細(xì)胞的直接接觸下才能向骨骼肌分化[33]。Vieira等[34]將ADSC與杜興氏肌萎縮患者的處于分化期的肌細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，萎縮的肌細(xì)胞開始增生，通過免疫熒光發(fā)現(xiàn)ADSC可以與病變的肌肉細(xì)胞發(fā)生融合，從而恢復(fù)萎縮肌肉的功能。

2.6 向神經(jīng)的分化

ADSC經(jīng)誘導(dǎo)可向神經(jīng)細(xì)胞分化，形成Ⅲβ微管蛋白[35]，分化后的細(xì)胞不僅具有類似于神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)，還會產(chǎn)生GFAP、nestin、Neun等胞內(nèi)產(chǎn)物。Kang等[36]發(fā)現(xiàn)ADSC的向神經(jīng)分化的能力要優(yōu)于BMSC。Aluigi等[37]發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)酶的變化，例如乙酰膽堿酯酶與膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的增加，但目前尚無證據(jù)說明ADSC可以被誘導(dǎo)成具有傳導(dǎo)神經(jīng)沖動的神經(jīng)細(xì)胞。

2.7 向內(nèi)分泌腺的分化

Timper等[38]利用誘導(dǎo)分化因子Activin-A、Exendin-4、HGF與Pentagastrin等，使ADSC表達(dá)胰腺細(xì)胞的表型。在誘導(dǎo)過程中，ADSC可以表達(dá)胰腺細(xì)胞特有的轉(zhuǎn)錄因子Isl-1、Ipf-1和Ngn3等，最終這些細(xì)胞可以分泌胰島素與胰高血糖素。被誘導(dǎo)分化的細(xì)胞除了正常的能量代謝以外，還可以分解脂肪，合成與分泌某些激素。

2.8 向肝細(xì)胞的分化

ADSC在含有肝細(xì)胞生長因子及抑瘤素M的誘導(dǎo)下可向肝細(xì)胞分化，表達(dá)肝細(xì)胞表型，并且可以分泌白蛋白與甲胎蛋白，吸收消化低密度脂蛋白并分泌尿苷[39]。

2.9 造血微環(huán)境的創(chuàng)建

ADSC可以短期構(gòu)建造血組織環(huán)境，為血細(xì)胞的分化生長提供重要因子，協(xié)助造血祖細(xì)胞的分化[40]。

3 展望

ADSC具有多向分化潛能，易獲得、易擴增，但是其分化機制尚不清楚，亟待進(jìn)一步研究。相信隨著對ADSC認(rèn)識的深入，ADSC將會在細(xì)胞治療和組織工程化組織構(gòu)建等再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮積極作用，擁有廣闊的應(yīng)用前景。

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Q813.1+1

B

1673－0364（2009）03－0173－04

2008年12月8日；

2009年2月13日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.06.017

200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科。