不同種子細(xì)胞在組織工程膀胱構(gòu)建中應(yīng)用的研究進(jìn)展

朱衛(wèi)東 徐月敏

不同種子細(xì)胞在組織工程膀胱構(gòu)建中應(yīng)用的研究進(jìn)展

朱衛(wèi)東 徐月敏

組織工程膀胱構(gòu)建的研究為膀胱缺損的修復(fù)提供了新的選擇，它避免了傳統(tǒng)的腸道代膀胱引起的代謝紊亂、感染、結(jié)石形成等并發(fā)癥。組織工程膀胱構(gòu)建研究中，種子細(xì)胞的選擇、體外培養(yǎng)及擴(kuò)增是關(guān)鍵，是成功構(gòu)建組織工程膀胱必不可少的條件[1]。理想的種子細(xì)胞應(yīng)該具備來(lái)源廣泛、易獲得，體外易于培養(yǎng)擴(kuò)增，與支架材料相容性好等優(yōu)點(diǎn)。本文主要就不同的種子細(xì)胞在組織工程膀胱構(gòu)建研究中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 自體成體細(xì)胞

通過(guò)膀胱組織活檢，獲取一定數(shù)量的自體成體細(xì)胞，操作簡(jiǎn)單，損傷小。在研究早期，正常的上皮細(xì)胞可以在實(shí)驗(yàn)室生長(zhǎng)，但在體外難以大量擴(kuò)增，老化問(wèn)題難以克服，從而限制了研究的進(jìn)展。2006年，D iego等[2]通過(guò)角質(zhì)上皮培養(yǎng)技術(shù)使得移行上皮細(xì)胞在體外得到了大規(guī)模擴(kuò)增，大大加速了膀胱組織工程的研究進(jìn)展。同時(shí)，體外培養(yǎng)的上皮具有抵抗尿液基本成分的屏障作用，適用于組織工程膀胱的構(gòu)建，更加推動(dòng)了組織工程膀胱研究的發(fā)展。Kurzrock等[3]將小鼠3T3細(xì)胞作為膀胱上皮細(xì)胞（Urothelial cells，UROs）原代培養(yǎng)的滋養(yǎng)層細(xì)胞，成功地將大鼠UROs體外連續(xù)培養(yǎng)超過(guò)10代，并且冷藏和復(fù)蘇對(duì)UROs的活性無(wú)明顯影響。Moriya等[4]將UROs與膀胱黏膜下層（Bladder acellular matrix graft，BAMG）復(fù)合培養(yǎng)后，異位回植到膀胱部分切除的大鼠的腸系膜上，術(shù)后7 d，α-SMC-actin或索蛋白（Desmin）陽(yáng)性的間質(zhì)細(xì)胞長(zhǎng)入BAMG，透射電鏡下此間質(zhì)細(xì)胞為肌纖維母細(xì)胞，術(shù)后14 d和28 d轉(zhuǎn)變?yōu)槠交蛹?xì)胞，術(shù)后56 d，進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維細(xì)胞。這說(shuō)明長(zhǎng)入BAMG的間質(zhì)細(xì)胞逐漸失去平滑肌細(xì)胞的特點(diǎn)，單純UROs存在的環(huán)境不能維持平滑肌樣間質(zhì)細(xì)胞的表型。Frey等[5]將膀胱上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞混合后種植于合成的水凝膠支架上進(jìn)行聯(lián)合培養(yǎng)，證明分層培養(yǎng)和“三明治”樣培養(yǎng)技術(shù)能誘導(dǎo)有序的細(xì)胞排列、有規(guī)律的假覆層尿路上皮形成和增加多層的平滑肌基質(zhì)，而單獨(dú)種植平滑肌或者尿路上皮細(xì)胞都沒(méi)有觀察到細(xì)胞長(zhǎng)入支架。Asharf等[6]將豬的膀胱上皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞接種于去黏膜結(jié)腸用于構(gòu)建膀胱組織，修補(bǔ)膀胱缺損。結(jié)果顯示修補(bǔ)區(qū)域被完整的上皮組織覆蓋，而無(wú)纖維化形成。而單純用去黏膜結(jié)腸修補(bǔ)則會(huì)形成大量瘢痕，且修補(bǔ)區(qū)無(wú)上皮組織覆蓋。因此，他們認(rèn)為接種細(xì)胞能夠抑制內(nèi)在的纖維化和去黏膜結(jié)腸的攣縮。Han等[7]采用酶消化法得到膀胱平滑肌細(xì)胞，可以在體外大量擴(kuò)增且能保持其原本細(xì)胞形態(tài)學(xué)、生物學(xué)特征，同時(shí)能與支架很好地黏附，為獲得更好的平滑肌細(xì)胞作為種子細(xì)胞提供了途徑。

Udo等[8]學(xué)將膀胱沖洗液離心，沉淀后得到的細(xì)胞用表皮生長(zhǎng)因子培養(yǎng)液體外培養(yǎng)，能夠形成復(fù)層的上皮結(jié)構(gòu)，表達(dá)AE1/AE3等上皮特異性抗體。

除了泌尿系統(tǒng)本身細(xì)胞，以自身的其他組織的細(xì)胞作為種子細(xì)胞進(jìn)行膀胱構(gòu)建研究也有報(bào)道。Lai等[9]將兔小腸的平滑肌細(xì)胞作為種子細(xì)胞在體外擴(kuò)增后用于膀胱構(gòu)建，與膀胱平滑肌細(xì)胞相比，在免疫組化、收縮性及形成的膀胱容量等方面均無(wú)明顯差異。因此，他們認(rèn)為小腸的平滑肌細(xì)胞同樣可以作為組織工程膀胱構(gòu)建的種子細(xì)胞，且具有來(lái)源廣泛，數(shù)量多等優(yōu)點(diǎn)。Bernhard等[10]將豬皮膚完全分化的角化上皮和成纖維細(xì)胞分別體外擴(kuò)增后接種于自體帶血管蒂去黏膜回腸片的兩面以構(gòu)建膀胱，術(shù)后3個(gè)月檢測(cè)其攣縮率為6.5%，新構(gòu)建的膀胱壁的膨脹性稍差，且沒(méi)有形成結(jié)石等并發(fā)癥。

2 干細(xì)胞

很多病理情況下，如膀胱外翻、膀胱發(fā)育不全及膀胱惡性病變時(shí)，自體膀胱組織不能提供正常功能的種子細(xì)胞。最近亦有研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的神經(jīng)性膀胱患者的膀胱平滑肌細(xì)胞（Bladder smooth muscle cells，BSMCs）生長(zhǎng)、分化、黏附及收縮性能均較正常BSMCs差，也不適合作為組織工程膀胱的種子細(xì)胞來(lái)源[11]。另有研究認(rèn)為，正常的自體成體細(xì)胞有許多不足，如體外培養(yǎng)增殖速率過(guò)慢、體外培養(yǎng)后其原有功能會(huì)出現(xiàn)明顯降低等[12]。干細(xì)胞在一定程度上彌補(bǔ)了上述缺陷。干細(xì)胞具有高度增殖和自我更新能力，且具有多向分化潛能，是理想的種子細(xì)胞來(lái)源。目前，由于醫(yī)學(xué)倫理方面存在著爭(zhēng)議，胚胎干細(xì)胞在組織工程膀胱構(gòu)建方面的研究幾乎處于空白，研究焦點(diǎn)主要聚焦于各種成體干細(xì)胞，其中間充質(zhì)干細(xì)胞是研究最為廣泛的。其取材范圍包括脂肪組織、骨膜、滑囊囊壁、肌肉、真皮、骨髓等。其中通過(guò)骨髓穿刺抽取所獲得的骨髓間充質(zhì)細(xì)胞，易培養(yǎng)，便于篩選，且可以向軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、表皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和其他一些間充質(zhì)來(lái)源的組織細(xì)胞分化[13-14]。Hegnera等[15]證明骨髓源性的干細(xì)胞在體外可以向平滑肌細(xì)胞進(jìn)行分化，表達(dá)出平滑肌肌動(dòng)蛋白等平滑肌細(xì)胞所特有的標(biāo)記，為間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)一步在組織工程膀胱中的應(yīng)用提供了很好的思路。

Zhang等[16]采用犬骨髓基質(zhì)細(xì)胞（Bone marrow stromal cell，BMSC）來(lái)構(gòu)建膀胱組織，結(jié)果顯示構(gòu)建組織在體外呈現(xiàn)鈣離子依賴(lài)性收縮反應(yīng)，收縮性與膀胱平滑肌相似，且同樣表達(dá)α-SMC-actin等平滑肌特異性標(biāo)記物；植入犬體內(nèi)后10周，可有平滑肌束生成。Chung等[17]將33只小鼠分為4組，一組為對(duì)照組，一組為部分膀胱切除加單純縫合組（OG），一組用單純SIS進(jìn)行膀胱擴(kuò)大重建（USG），剩余一組采用骨髓間質(zhì)干細(xì)胞-SIS復(fù)合物行膀胱擴(kuò)大術(shù)（SSG）。術(shù)后1個(gè)月發(fā)現(xiàn)，在USG組和SSG組中出現(xiàn)與對(duì)照組相同的緊密細(xì)胞群，而在SSG組中更可見(jiàn)到基底細(xì)胞層中有明顯增生的尿路上皮細(xì)胞。3個(gè)月后，各組中均出現(xiàn)了尿路上皮的增生和肌束的形成，同時(shí)還伴有神經(jīng)染色陽(yáng)性。RT-PCR發(fā)現(xiàn)，SSG組中CⅠ、CⅢ和MHC的含量明顯高于USG組。

脂肪干細(xì)胞(Adipose-derived stem cells，ADSCs)取材方便，來(lái)源廣泛，且比其他成體干細(xì)胞具有更高的增殖率及向其他類(lèi)型細(xì)胞的分化能力[18]。Gregory等[19]將經(jīng)綠色熒光蛋白標(biāo)記的脂肪干細(xì)胞注入大鼠膀胱壁內(nèi)，4周后發(fā)現(xiàn)經(jīng)標(biāo)記的脂肪干細(xì)胞長(zhǎng)入膀胱壁的平滑肌內(nèi)，12周后表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白等平滑肌特異性標(biāo)記物。

Shing等[20]將肌源性干細(xì)胞(Muscle-derived cell)種植于SIS之上，證實(shí)肌源性干細(xì)胞可以在無(wú)細(xì)胞基質(zhì)上生長(zhǎng)并能提供一定的張力,為其作為組織工程膀胱的種子細(xì)胞提供了可能。Yokoyama等[21]將鼠的肌源性干細(xì)胞分離培養(yǎng)后，分別回注膀胱左右側(cè)壁，于5 d、35 d、70 d分別取出膀胱壁行重型肌球蛋白鏈及β-半乳糖苷酶染色，顯示均為陽(yáng)性，證實(shí)注入的細(xì)胞可以長(zhǎng)期存活，并可以轉(zhuǎn)化為平滑肌。

Oottamasathien等[22]將經(jīng)擴(kuò)增的尿路上皮細(xì)胞與孕14 d的胚胎小鼠的膀胱間充質(zhì)細(xì)胞復(fù)合，片狀埋入免疫缺陷小鼠的腎周，28 d后取出。通過(guò)免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，有成熟的尿路上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的分化。而單獨(dú)種植尿路上皮細(xì)胞和膀胱間質(zhì)細(xì)胞均沒(méi)發(fā)現(xiàn)膀胱組織。

Ominic等[23]為胚胎源性的干細(xì)胞與膀胱平滑肌細(xì)胞、尿路上皮細(xì)胞共同培養(yǎng)，或者各自單獨(dú)培養(yǎng)。8 d后顯示，干細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)的生長(zhǎng)速度為0.3～0.7 mm/d，與之同樣培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)速度為0.1～0.3 mm/d，而尿路上皮為0.1～0.2 mm/d。將上述細(xì)胞混合培養(yǎng)，干細(xì)胞的生長(zhǎng)速度提高至0.5～1.0 mm/d。另外，干細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)呈環(huán)狀生長(zhǎng)，而混合培養(yǎng)時(shí)呈線(xiàn)性生長(zhǎng)，提示干細(xì)胞在與其他細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)時(shí)可能釋放出一些趨化信號(hào)。Coppi等[24]的研究也獲得了相似的結(jié)論，他們?cè)趦鰝螂椎陌螂妆谏献⑸淙牍撬栝g質(zhì)干細(xì)胞以觀察其對(duì)膀胱的修復(fù)情況。細(xì)胞植入后30 d，僅有很少的干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為平滑肌細(xì)胞，大部分細(xì)胞失去了特異分化的能力，且彼此融合。但是，這些干細(xì)胞的存在阻止了一般膀胱損傷后會(huì)發(fā)生的平滑肌細(xì)胞肥大現(xiàn)象。

3 展望

目前的臨床技術(shù)，對(duì)于膀胱的缺損修復(fù)以及功能重建尚有很大的不足。組織工程膀胱構(gòu)建的可能性給臨床患者帶來(lái)了新的希望。隨著組織工程膀胱構(gòu)建研究的深入，各種原因?qū)е碌陌螂兹睋p，將會(huì)獲得更好地修復(fù)。

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Q813.1+3

B

1673－0364（2009）03－0171－03

2008年7月15日；

2008年8月31日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.06.016

200233上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第六人民醫(yī)院泌尿外科。