組織工程半月板的研究進(jìn)展

趙貴慶 崔磊 曹誼林

·綜述·

組織工程半月板的研究進(jìn)展

趙貴慶 崔磊 曹誼林

軟骨是高等動(dòng)物體內(nèi)一種無(wú)血管的致密結(jié)締組織，由位于軟骨陷窩內(nèi)的軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成。根據(jù)構(gòu)成軟骨的細(xì)胞外基質(zhì)成分的不同，軟骨分為透明軟骨、彈性軟骨和纖維軟骨。纖維軟骨組織存在于椎間盤(pán)、恥骨聯(lián)合、半月板、顳下頜關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)盤(pán)以及肌腱與骨的附著部位等處。纖維軟骨的細(xì)胞外基質(zhì)中含有大量呈平行或交叉排列的由Ⅰ型膠原構(gòu)成的膠原纖維束，軟骨細(xì)胞單個(gè)、成對(duì)或成單行排列，分布于纖維束之間，基質(zhì)中無(wú)定形成分。

半月板是膝關(guān)節(jié)內(nèi)兩塊呈新月形的纖維軟骨組織，對(duì)膝關(guān)節(jié)的正常功能有至關(guān)重要的作用，它能傳導(dǎo)并分散應(yīng)力至脛骨平臺(tái)、吸收震蕩、提高膝關(guān)節(jié)的穩(wěn)定性、增加膝關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)幅度并促進(jìn)關(guān)節(jié)液循環(huán)[1]。半月板損傷是骨科的常見(jiàn)病，多由劇烈運(yùn)動(dòng)甚至不恰當(dāng)?shù)呢?fù)重引起。半月板的外側(cè)1/3有來(lái)自關(guān)節(jié)囊的血管滋養(yǎng)，發(fā)生在這一區(qū)域的損傷具有一定的自我修復(fù)能力；發(fā)生于內(nèi)側(cè)區(qū)的損傷由于沒(méi)有血運(yùn)，其自我修復(fù)能力差，損傷往往不能愈合，從而引起疼痛和功能障礙，影響患者的工作生活。遠(yuǎn)期的病理的改變主要是關(guān)節(jié)軟骨的退行性改變，表現(xiàn)為骨關(guān)節(jié)炎的癥狀[2]。目前，越來(lái)越多的外科醫(yī)生認(rèn)識(shí)到半月板對(duì)于膝關(guān)節(jié)功能的重要性，針對(duì)的治療措施是以盡可能地保留半月板為原則采用半月板修復(fù)術(shù)，無(wú)法修復(fù)的半月板常被部分或全部切除，這種措施雖然可以暫時(shí)緩解疼痛，但并不能逆轉(zhuǎn)或阻止關(guān)節(jié)軟骨退行性改變的發(fā)生。對(duì)半月板全切術(shù)后的患者采用同種異體半月板移植是一種可能的選擇，對(duì)延緩關(guān)節(jié)軟骨退行性改變的發(fā)生有一定的作用。但是，同種異體半月板移植供體有限，存在著疾病傳播的可能，且半月板的形態(tài)個(gè)體之間存在差異，隨訪發(fā)現(xiàn)移植后的半月板有收縮的趨勢(shì)[3]。

組織工程的發(fā)展為半月板缺損的治療提供了新的思路，成為基礎(chǔ)和臨床研究的熱點(diǎn)?；诮M織工程原理的治療措施包括：應(yīng)用種子細(xì)胞促進(jìn)半月板損傷的愈合；應(yīng)用天然或人工合成的半月板假體替代切除的半月板組織；體外構(gòu)建組織工程化半月板，然后植入體內(nèi)，實(shí)現(xiàn)半月板的再生。本文就組織工程半月板研究的現(xiàn)狀進(jìn)行綜述。

1 種子細(xì)胞

理想的組織工程半月板種子細(xì)胞，應(yīng)來(lái)源于自體細(xì)胞，分布廣泛、取材方便、對(duì)機(jī)體損傷小，體外增殖能力強(qiáng)并不易老化，且能產(chǎn)生大量的細(xì)胞外基質(zhì)。

半月板纖維軟骨細(xì)胞是最早被研究用來(lái)作為種子細(xì)胞的。Webber等[4]于1985年首次報(bào)道了半月板纖維軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)和增殖的特性，并根據(jù)細(xì)胞的形態(tài)，提出半月板纖維軟骨細(xì)胞是是由兩類性質(zhì)不同的細(xì)胞構(gòu)成。半月板纖維軟骨細(xì)胞在體外無(wú)支架、高密度培養(yǎng)條件下，并不像透明軟骨細(xì)胞那樣可以形成軟骨組織，形成的組織類似于半月板的纖維結(jié)締組織部分，僅有少量的蛋白多糖和Ⅰ型膠原的分泌[5-6]。纖維軟骨細(xì)胞與Ⅰ型膠原支架材料復(fù)合在體外培養(yǎng)3周后，支架內(nèi)部的細(xì)胞呈圓形或橢圓形，細(xì)胞周圍有基質(zhì)形成，但未見(jiàn)有軟骨陷窩結(jié)構(gòu)的形成[7]。但是將其接種在PGA支架或藻酸鈣凝膠中，細(xì)胞材料復(fù)合物可以在裸鼠皮下形成纖維軟骨樣組織[8]。應(yīng)用半月板纖維軟骨細(xì)胞作為種子細(xì)胞接種支架材料修復(fù)半月板全缺損或部分缺損的實(shí)驗(yàn)顯示，細(xì)胞材料復(fù)合物在體內(nèi)3～6個(gè)月后能形成與正常半月板組織相似的纖維軟骨組織，具有半月板的白區(qū)和紅區(qū)的組織學(xué)特征[9-11]。研究所用的細(xì)胞都是從幼年動(dòng)物的半月板中分離培養(yǎng)的，其增殖和產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)的能力較強(qiáng)。大多數(shù)半月板損傷的病人是成年人，其半月板源性纖維軟骨細(xì)胞的GAG和膠原合成能力以及體外增殖能力隨著年齡增長(zhǎng)而顯著降低[12-14]。體外培養(yǎng)的半月板細(xì)胞隨著擴(kuò)增倍數(shù)的增加其成軟骨的能力逐漸減弱，體外擴(kuò)增3～4代后，細(xì)胞僅合成Ⅰ型膠原而不合成Ⅱ型膠原，表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞的特性[12]。采用自體半月板細(xì)胞要求患者接受兩次手術(shù)，第一次用開(kāi)放手術(shù)或關(guān)節(jié)鏡取出受損的半月板組織用于種子細(xì)胞的分離培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的體外培養(yǎng)，形成可回植的組織工程半月板后，再次手術(shù)修復(fù)半月板的缺損，整個(gè)治療周期較長(zhǎng)，而且從患者的損傷半月板中分離的纖維軟骨細(xì)胞數(shù)量有限，難以滿足組織工程半月板構(gòu)建對(duì)種子細(xì)胞量的需求[15]。應(yīng)用同種異體半月板纖維軟骨細(xì)胞修復(fù)兔半月板缺損的實(shí)驗(yàn)表明，在回植后6～10周后，植入物有少量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，36周后形成類似半月板的纖維軟骨組織，植入物周圍沒(méi)有明顯的炎性肉芽組織形成[16]。該結(jié)果提示，半月板組織尤其是半月板的內(nèi)側(cè)無(wú)血管區(qū)可能具有免疫豁免的特性，同種異體的半月板細(xì)胞可以在此部位存活并發(fā)揮正常的生理功能。但是要獲取人的同種異體半月板細(xì)胞還受到供體來(lái)源的限制。顯然，半月板纖維軟骨細(xì)胞并不是一種理想的組織工程半月板種子細(xì)胞。

關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞是組織工程化軟骨構(gòu)建中研究得最多的種子細(xì)胞。關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞在體外單層培養(yǎng)擴(kuò)增期間，細(xì)胞逐漸表達(dá)Ⅰ型膠原，表達(dá)Ⅱ型膠原的能力下降，而這正是纖維軟骨細(xì)胞區(qū)別于透明軟骨細(xì)胞的特點(diǎn)之一。透明軟骨細(xì)胞在體外三維培養(yǎng)條件下能產(chǎn)生6倍于纖維軟骨的GAG，其膠原的合成能力也強(qiáng)于后者[17]。Peretti等[18]將豬的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞作為組織工程半月板的種子細(xì)胞，接種在滅活的同種異體半月板材料上修復(fù)自體半月板缺損，9周后實(shí)驗(yàn)組有愈合的表現(xiàn)，而對(duì)照組無(wú)一愈合。Weinand等[19]將豬的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞和耳軟骨細(xì)胞體外分離擴(kuò)增后，接種在Vicryl mesh支架上，植入自體或異體半月板無(wú)血管區(qū)的圓形缺損處（直徑1 cm），12周后不論自體還是異體缺損都得到很好的修復(fù)。但是，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞在體外擴(kuò)增后會(huì)去分化為僅分泌Ⅰ型膠原的細(xì)胞表型，GAG的合成能力也明顯降低[20]；另外，關(guān)節(jié)軟骨的獲取需要損傷功能上更為重要的關(guān)節(jié)面，因此關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞將不會(huì)被作為組織工程化纖維軟骨的種子細(xì)胞而應(yīng)用于臨床。

干細(xì)胞具有旺盛的體外增殖能力和定向分化特性，因而成為了眾多學(xué)者的研究方向。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）是一種成體干細(xì)胞，容易獲得，可以體外擴(kuò)增、定向（多向）誘導(dǎo)分化。TGF-β是誘導(dǎo)BMSC向軟骨細(xì)胞分化的重要生長(zhǎng)因子，單層培養(yǎng)條件下，2周后表達(dá)Ⅱ型膠原[21]。應(yīng)用TGF-β誘導(dǎo)的BMSC可以修復(fù)豬關(guān)節(jié)非負(fù)重區(qū)的軟骨缺損，表達(dá)軟骨特異的細(xì)胞外基質(zhì)成分[22]。從骨髓中分離的單核細(xì)胞注射于半月板裂傷部位，可以促進(jìn)半月板損傷的愈合[23]。BMSC可以在半月板的無(wú)血管區(qū)存活，并產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)[15]，在支架材料上體外三維培養(yǎng)較半月板纖維軟骨細(xì)胞在相同條件下能產(chǎn)生更多的膠原和GAG[24]。Angele等[25]用兔的自體BMSC作為種子細(xì)胞，接種于透明質(zhì)酸酯和凝膠構(gòu)成的支架材料上，體外培養(yǎng)2周，回植入內(nèi)側(cè)半月板中份5 mm的缺損處，回植后12周，實(shí)驗(yàn)組明顯優(yōu)于單純支架對(duì)照組，有纖維軟骨樣組織形成。徐青鐳等[26-27]應(yīng)用兔的BMSC作為種子細(xì)胞，在體外擴(kuò)增并用bFGF和TGF-β1誘導(dǎo)，然后接種于膠原-GAG支架上植入體內(nèi)，術(shù)后3～6個(gè)月，形成纖維軟骨樣組織，有軟骨陷窩形成，細(xì)胞外基質(zhì)中有大量平行分布的膠原纖維束和酸性黏多糖。雖然BMSC有自發(fā)成骨的傾向，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)有部分新生的纖維軟骨內(nèi)有肥大軟骨細(xì)胞和骨形成[28]，但是應(yīng)用適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)方案，BMSC是較有臨床可行性的組織工程纖維軟骨種子細(xì)胞。

胚胎干細(xì)胞具有無(wú)限增殖能力和全能分化潛能。體外研究顯示，胚胎干細(xì)胞在一定的誘導(dǎo)條件下，可以表達(dá)Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原和GAG，表現(xiàn)出向纖維軟骨分化的特性[29]。但由于受到醫(yī)學(xué)倫理等的制約，目前尚缺乏進(jìn)一步的研究。

成纖維細(xì)胞是源于中胚層的一種間質(zhì)細(xì)胞，其廣泛存在于機(jī)體的各種組織中，被認(rèn)為是具有組織特異性的背景細(xì)胞[30]。真皮成纖維細(xì)胞是皮膚中含量最為豐富的一種細(xì)胞，它表達(dá)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅶ型膠原和透明質(zhì)酸、彈性蛋白、多能蛋白聚糖（Versican）、核心蛋白多糖（Decorin）以及層黏連蛋白等[31]。

真皮成纖維細(xì)胞在一定的培養(yǎng)條件和誘導(dǎo)因子作用下可以向骨[32]、軟骨[33-43]、成肌纖維細(xì)胞[44-45]、角膜基質(zhì)細(xì)胞[46]分化，表現(xiàn)出多潛能分化的特性。成體皮膚成纖維細(xì)胞經(jīng)過(guò)胰島素預(yù)處理后，接種在有聚集蛋白多糖涂層的培養(yǎng)皿上，能表達(dá)更多Ⅱ型膠原和Aggrecan[34]。人皮膚成纖維細(xì)胞在含有脫鈣骨粉的膠原三維支架中培養(yǎng)，具有向軟骨分化的趨向[35-36，41-42]。低氧環(huán)境有助于成纖維細(xì)胞分泌軟骨特異的細(xì)胞外基質(zhì)[40]。在低氧條件下當(dāng)培養(yǎng)液中含有40 mM的乳酸時(shí)可以誘導(dǎo)其表達(dá)軟骨特異的細(xì)胞外基質(zhì)[43]。低氧和蛋白激酶C阻滯劑聯(lián)合作用，可以使成纖維細(xì)胞分泌軟骨細(xì)胞表型的基質(zhì)[47]。應(yīng)用SOX5、SOX6、SOX9聯(lián)合轉(zhuǎn)染人皮膚成纖維細(xì)胞3 d內(nèi)即有Ⅱ型膠原和Aggrecan表達(dá)[37]。人的真皮成纖維細(xì)胞與豬的軟骨細(xì)胞在三維條件下共培養(yǎng)，形成軟骨樣組織，一部分真皮成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為軟骨細(xì)胞[48]。本實(shí)驗(yàn)室早期的研究發(fā)現(xiàn)，人的皮膚成纖維細(xì)胞在軟骨源性形態(tài)發(fā)生蛋白-1(CDMP-1)的作用下能分泌軟骨特異的細(xì)胞外基質(zhì)（Ⅱ型膠原和Aggrecan）；在高密度無(wú)支架三維培養(yǎng)條件下，軟骨細(xì)胞的表型可以長(zhǎng)期維持[33]。皮膚成纖維細(xì)胞取材簡(jiǎn)便、繼發(fā)損傷小、體外增殖合成能力旺盛、經(jīng)多次傳代仍保持較好的增殖能力，是一種較理想的構(gòu)建組織工程半月板的種子細(xì)胞。

2 支架材料

理想的半月板支架材料應(yīng)當(dāng)具有良好的生物相容性和生物可降解性，而且應(yīng)當(dāng)有提供細(xì)胞黏附生長(zhǎng)和產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在支架中的擴(kuò)散效率能提供相對(duì)穩(wěn)定的適宜的細(xì)胞代謝所需的化學(xué)環(huán)境，能結(jié)合細(xì)胞生長(zhǎng)所需的刺激性或抑制性細(xì)胞因子。另外，支架材料要具有一定的機(jī)械強(qiáng)度，能適應(yīng)關(guān)節(jié)內(nèi)的力學(xué)條件而保持結(jié)構(gòu)的完整性[3]。

基于上述因素的考慮，已有多種生物材料被用于組織工程半月板的構(gòu)建研究。其中，天然生物材料包括纖維凝塊、骨膜、軟骨膜、肌腱、小腸黏膜下層、膠原制品以及滅活的同種異體半月板組織。纖維凝塊是最早應(yīng)用于半月板的生物材料，Arnoczky等[49]于1986年應(yīng)用外源性的Fibrin blot修復(fù)狗的半月板撕裂模型。1990年，Henning等[50]將該技術(shù)用于臨床，在術(shù)中獲取患者的自體血，體外形成凝塊后，注射在半月板撕裂處以促進(jìn)損傷的愈合。進(jìn)一步的研究表明，半月板細(xì)胞可以向纖維凝塊內(nèi)遷移，并合成細(xì)胞外基質(zhì)[15]，半月板纖維軟骨細(xì)胞與纖維凝塊混合可以在體內(nèi)促進(jìn)半月板損傷的愈合[51]。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞也可以在纖維凝塊內(nèi)存活并增殖，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示能促進(jìn)新生半月板樣組織的形成[52]。骨膜組織植入半月板缺損區(qū)后不能形成纖維軟骨組織，而是形成一個(gè)覆蓋著透明軟骨組織的楔形骨組織[28]。這顯然與骨膜中含有的大量成骨細(xì)胞有關(guān)，在關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境中表現(xiàn)為軟骨內(nèi)成骨的過(guò)程。而自體肋軟骨膜植入半月板全缺損模型后，可以形成纖維軟骨樣組織，組織學(xué)形態(tài)與正常半月板極為相似[53]。脂肪細(xì)胞[54]、肌腱細(xì)胞[55]在關(guān)節(jié)內(nèi)也會(huì)形成纖維軟骨樣組織，而且對(duì)關(guān)節(jié)軟骨有一定的保護(hù)作用。但是這些組織的力學(xué)強(qiáng)度有限，植入早期不能承載膝關(guān)節(jié)內(nèi)的壓力強(qiáng)度，往往導(dǎo)致半月板的內(nèi)側(cè)緣不能形成，對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)作用有限，以致遠(yuǎn)期都會(huì)產(chǎn)生骨關(guān)節(jié)炎的癥狀。

來(lái)源于天然膠原的生物材料具有良好的組織相容性、低抗原性、生物可降解性[7]，在制藥和生物材料領(lǐng)域得到了深入研究和廣泛應(yīng)用，并已有多種膠原產(chǎn)品得到批準(zhǔn)而用于臨床。膠原半月板支架材料也是研究最為成熟的半月板替代物。未交聯(lián)的膠原支架材料較化學(xué)交聯(lián)后的支架材料具有更好的生物相容性[56]，植入半月板缺損部位后可吸引關(guān)節(jié)內(nèi)的細(xì)胞浸潤(rùn)生長(zhǎng)，最終可以形成纖維軟骨組織[57]。由Ⅰ型膠原、硫酸軟骨素和透明質(zhì)酸復(fù)合生產(chǎn)的膠原半月板植入物（CMI）,已應(yīng)用于臨床。CMI表現(xiàn)出良好的治療效果，形成了纖維軟骨組織[58]，明顯改善了患者膝關(guān)節(jié)的癥狀，延緩了關(guān)節(jié)軟骨的退行性改變。將CMI接種上羊的自體半月板細(xì)胞修復(fù)半月板全缺損模型，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組新生半月板在血管化、塑形、基質(zhì)含量等方面優(yōu)于未接種細(xì)胞的對(duì)照組[10]。徐青鐳等[27]應(yīng)用膠原-糖氨聚糖支架負(fù)載骨髓基質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)自體半月板缺損，形成了半月板樣纖維軟骨組織。

除了天然生物材料之外，許多學(xué)者對(duì)人工合成的高分子聚合物生物材料作為組織工程化纖維軟骨的支架材料也進(jìn)行了深入的研究，其中研究最多的是聚羥基乙酸（PGA）和聚乳酸(PLA)。PGA具有良好的生物相容性和生物可降解性，其降解產(chǎn)物羥乙酸對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用，可最終代謝為CO2和H2O。PGA纖維可以通過(guò)PLA的有機(jī)溶劑塑形，提高支架材料的力學(xué)性能[16]。PGA的孔隙率較大，而且降解速度可以人為控制，是研究纖維軟骨細(xì)胞在三維條件下的生物學(xué)行為的良好的載體[59-60]。以PGA-PLGA構(gòu)建的支架材料負(fù)載同種異體纖維軟骨細(xì)胞實(shí)現(xiàn)了兔全半月板的構(gòu)建，支架材料完成降解[16]。其他用于組織工程纖維軟骨的高分子生物材料還有聚酯和高分子水凝膠。為了提高材料的生物活性和力學(xué)性能，越來(lái)越多的研究關(guān)注于天然材料與人工合成材料復(fù)合生物材料的研究。天然材料具有良好的生物相容性，但是力學(xué)強(qiáng)度不能達(dá)到生理半月板的功能要求，而人工合成的材料往往具有良好的機(jī)械性能，但其生物活性不高，復(fù)合材料就是利用兩者的優(yōu)點(diǎn)，形成既具有一定力學(xué)強(qiáng)度又有良好生物活生的支架材料，如Ⅰ型膠原涂層的聚酯類生物材料[61]、含有透明質(zhì)酸和聚己酸內(nèi)酯的支架材料[62]等。

3 生長(zhǎng)因子

生長(zhǎng)因子是指能促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化、成熟的細(xì)胞因子。目前，用于組織工程纖維軟骨的生長(zhǎng)因子已經(jīng)有很多種。轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）是研究最多的生長(zhǎng)因子，它可以促進(jìn)體外單層培養(yǎng)[63]和三維培養(yǎng)[60，64]的半月板纖維軟骨細(xì)胞分泌膠原和GAG，維持纖維軟骨細(xì)胞的表型。其作用強(qiáng)于胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）、PDGF-AB血小板源性生長(zhǎng)因子-AB（PDGF-AB）和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）。TGF-β針對(duì)PGA支架材料上三維培養(yǎng)的羊半月板纖維軟骨細(xì)胞，主要是促進(jìn)其Ⅰ型膠原的合成，對(duì)Ⅱ型膠原的合成沒(méi)有促進(jìn)作用[64]；而對(duì)藻酸鹽凝膠中三維培養(yǎng)的人半月板纖維軟骨細(xì)胞有明顯的促進(jìn)其Ⅱ型膠原合成的作用[65]。這種差別可能是由于藻酸鹽凝膠培養(yǎng)條件更接近于纖維軟骨細(xì)胞的生理環(huán)境，有助于細(xì)胞表型的維持。TGF-β是通過(guò)抑制結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）的表達(dá)來(lái)發(fā)揮其生物效應(yīng)的。CTGF是胚胎時(shí)期誘導(dǎo)組織形成的重要生長(zhǎng)因子，能促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖。TGF-β通過(guò)抑制細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞分化和合成功能，分泌和沉積細(xì)胞外基質(zhì)[66]。TGF-β與其他生長(zhǎng)因子聯(lián)合應(yīng)用可以使多潛能細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化，表達(dá)軟骨特異的細(xì)胞外基質(zhì)成分。TGF-β與堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)[26]、胰島素樣生長(zhǎng)子-1(IGF-1)[67]能產(chǎn)生協(xié)同作用，以誘導(dǎo)間充質(zhì)來(lái)源的細(xì)胞向軟骨細(xì)胞表型分化。

軟骨源性形態(tài)發(fā)生蛋白（CDMPs）是骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）家族中的新亞型，也是TGF-β亞群中的一個(gè)成員。CDMP-1是四肢骨發(fā)育，尤其是早期軟骨發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子，能促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞的聚集和向軟骨分化。該基因的缺陷可以引起四肢骨，尤其是肢端的發(fā)育障礙[68]。CDMP-1能誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的韌帶成纖維細(xì)胞和皮膚成纖維細(xì)胞向軟骨細(xì)胞表型分化[69，33]。CDMP-1轉(zhuǎn)染的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞可以促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨缺損的愈合[70]。TGF-β與CDMP-1聯(lián)合，可以誘導(dǎo)人胚胎來(lái)源的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原和GAG，使之分化為纖維軟骨細(xì)胞[71]。這表明，CDMP-1是間充質(zhì)來(lái)源細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的重要生長(zhǎng)因子。

表皮生長(zhǎng)因子（EGF）是從來(lái)自鼠頜下腺的神經(jīng)生長(zhǎng)因子中發(fā)現(xiàn)的。在離體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，EGF對(duì)成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞具有促有絲分裂作用。它與TGF-β具有相同的受體,兩者協(xié)同可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖，有助于組織工程半月板的血管化。腺病毒載體編碼的肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）轉(zhuǎn)染半月板細(xì)胞可促進(jìn)細(xì)胞材料復(fù)合物血管化[72]。HGF與PDGF聯(lián)合應(yīng)用，可以趨化半月板細(xì)胞向損傷部位遷移并產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)[73]。

在成體干細(xì)胞或分化細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的過(guò)程中，外源性細(xì)胞因子的加入發(fā)揮著不可或缺的作用[28]。選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞因子在組織工程半月板的構(gòu)建過(guò)程中具有重要的意義。

4 力學(xué)因素

半月板在膝關(guān)節(jié)內(nèi)起著應(yīng)力傳導(dǎo)、穩(wěn)定和潤(rùn)滑關(guān)節(jié)的作用。半月板的外側(cè)紅區(qū)組織學(xué)上與肌腱相似，是由Ⅰ型膠原構(gòu)成的致密結(jié)締組織構(gòu)成，主要承受拉力負(fù)荷；內(nèi)側(cè)白區(qū)則與透明軟骨和肌腱的腱帽相似，主要承受壓力負(fù)荷[1]。應(yīng)力刺激是半月板發(fā)育過(guò)程中必不可少的條件之一。雞胚中雖然可以看到發(fā)育的半月板，但是半月板是卷曲退化的，即使是完全發(fā)育的半月板，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的固定后也表現(xiàn)出退化的傾向[1]。對(duì)離體半月板機(jī)械刺激顯示，靜態(tài)壓力能抑制膠原和糖蛋白前體的攝取，而動(dòng)態(tài)變化的壓力則具有較高的蛋白多糖的表達(dá)。應(yīng)用生物反應(yīng)器對(duì)細(xì)胞懸液中的膠原材料施加壓力負(fù)荷，結(jié)果實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的浸潤(rùn)和組織的再生均不如對(duì)照組[56]。對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞與支架材料復(fù)合物施加周期性的動(dòng)態(tài)壓力刺激可以上調(diào)膠原和蛋白多糖的表達(dá)水平，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的分泌[74]。組織工程半月板應(yīng)用于臨床必須達(dá)到3個(gè)力學(xué)要求：①新生的半月板組織達(dá)到生理半月板的力學(xué)強(qiáng)度；②新生半月板的幾何形狀與受體的關(guān)節(jié)相適應(yīng)；③新生半月板回植后能與脛骨平臺(tái)很好的連接[75]。力學(xué)刺激對(duì)于提高組織工程化半月板的機(jī)械強(qiáng)度有著不可代替的作用[76]。由于生物反應(yīng)器的研究滯后，對(duì)于如何施加力學(xué)刺激、何時(shí)施加，以及力的強(qiáng)度等，都還有待進(jìn)一步的研究。

5 展望

組織工程研究要從實(shí)驗(yàn)室研究走向臨床應(yīng)用還面臨著巨大的挑戰(zhàn)。第一，如何有效地對(duì)人體組織進(jìn)行成規(guī)模的體外培養(yǎng)；第二，如何構(gòu)建能滿足體內(nèi)力學(xué)要求的成熟的功能化組織工程組織[76]；第三，如何將構(gòu)建的組織工程化組織植入體內(nèi)，發(fā)揮其生理功能。組織工程半月板也面臨著同樣的問(wèn)題。選擇合適的種子細(xì)胞，并體外構(gòu)建成熟的組織工程半月板將是以后研究的重點(diǎn)。

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Q813.1+2

B

1673－0364（2009）03－0166－05

2008年10月25日；

2009年2月3日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.06.015

410000湖南省長(zhǎng)沙市亞韓醫(yī)學(xué)美容醫(yī)院（趙貴慶）；200235上海市上海組織工程研究與開(kāi)發(fā)中心（崔磊，曹誼林）。