協(xié)同凝集實(shí)驗(yàn)診斷副溶血性弧菌感染的初步探討

266071 濟(jì)南軍區(qū)青島第二療養(yǎng)院檢驗(yàn)中心 于慶潭 鄭紅霞253000 濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院 李 偉

協(xié)同凝集實(shí)驗(yàn)診斷副溶血性弧菌感染的初步探討

266071 濟(jì)南軍區(qū)青島第二療養(yǎng)院檢驗(yàn)中心 于慶潭 鄭紅霞253000 濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院 李 偉

目的 建立了一種快速簡(jiǎn)便的副溶血性弧菌的檢測(cè)方法。方法 將抗副溶血性弧菌多克隆抗體包被到金黃色葡萄球菌Cowan I株上制成SPA菌體試劑，建立協(xié)同凝集試驗(yàn)(COA)，檢測(cè)樣品中可能的副溶血性弧菌。結(jié)果 COA檢測(cè)的敏感性為2×106cfu/mL，檢測(cè)過(guò)程為5 min。112份臨床標(biāo)本的測(cè)定結(jié)果與培養(yǎng)法相比較，COA的特異性、敏感性、診斷符合率分別是100%、94.2%、97.3%。結(jié)論 本研究為發(fā)展簡(jiǎn)便、敏感和快速的副溶血性弧菌的協(xié)同凝集檢測(cè)試劑鑒定基礎(chǔ)。

副溶血性弧菌；協(xié)同凝集試驗(yàn)；檢測(cè)方法

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)是海洋和鹽湖中分布廣泛的一種嗜鹽性病原菌。廣泛分布在近海岸的海水、海底沉積物、魚(yú)類、貝類中，適應(yīng)于高濃度(6%)食鹽的環(huán)境中生長(zhǎng)，在不含食鹽的培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)。該菌是亞于霍亂弧菌的一種常見(jiàn)腸道致病菌，其污染會(huì)給海水養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重?fù)p失，還會(huì)引起人類腹瀉等腸道疾病及食物中毒，出現(xiàn)腹瀉呈水樣或血樣便、腹部痙攣、惡心、嘔吐和頭痛等癥狀[1-6]。自2001年以來(lái)，副溶血性弧菌性食物中毒爆發(fā)已經(jīng)成為中國(guó)最常見(jiàn)的食源性疾患，副溶血性弧菌性食物中毒的起數(shù)和人數(shù)一直處于第一位。

多數(shù)金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁內(nèi)含有一種特殊的蛋白質(zhì)，稱為葡萄球菌A蛋白質(zhì) (staphylococcal protein A,SPA)，SPA的分子量為42 000，等電點(diǎn)為5.1，一個(gè)分子內(nèi)有4個(gè)相似的活性部位，能與人及多種哺乳動(dòng)物(豬、兔、豚鼠等)血清中IgG類抗體的Fc段非特異性結(jié)合。IgG的Fc段與SPA結(jié)合后，兩個(gè)Fab段暴露在葡萄球菌菌體表面，仍保持其結(jié)合抗原的活性和特異性，當(dāng)其與特異性抗原相遇時(shí)，能出現(xiàn)特異的凝集現(xiàn)象。在此凝集中，金黃色葡萄球菌菌體形成了反應(yīng)的載體，故稱協(xié)同凝集試驗(yàn)(coagglutination test)。協(xié)同凝集試驗(yàn)可用于微生物的快速診斷、定種及定型，以協(xié)助傳染病的早期診斷。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用協(xié)同凝集試驗(yàn)建立了副溶血性弧菌的檢測(cè)方法，為制備副溶血性弧菌的協(xié)同凝集檢測(cè)試劑盒鑒定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 菌株來(lái)源：疑似副溶血性弧菌標(biāo)本92份，取自2007年7～9月間醫(yī)院就診病人。按培養(yǎng)檢測(cè)法接種堿性蛋白胨水37℃增菌鑒定。陽(yáng)性對(duì)照本院檢驗(yàn)室提供，菌液濃度為1.3×108cfu/mL。大腸埃希菌20份，傷寒沙門(mén)菌10份由本科細(xì)菌室提供。免疫原與反應(yīng)原：將培養(yǎng)后副溶血性弧菌用0.5%的甲醛PBS配成濃度約10億/mL的菌液，作為接種家兔用的免疫原，同時(shí)也作為試管凝集反應(yīng)的反應(yīng)原。動(dòng)物：體重2 kg以上的雄性健康家兔10只，免疫接種前經(jīng)檢測(cè)血清副溶血性弧菌抗體滴度均為陰性。富含SPA的葡萄球菌購(gòu)自晶美公司。

1.2 副溶血性弧菌多抗血清的制備 采用睪丸內(nèi)接種法，雙側(cè)睪丸各注射0.5 mL同種免疫原。8只家兔分別用經(jīng)甲醛處理的4株副溶血性弧菌免疫原，2只家兔用經(jīng)紫外線處理的1株免疫原進(jìn)行免疫接種，一次接種后，定期采血檢測(cè)抗體滴度，觀察抗體漲消情況，待抗體滴度明顯下降后，進(jìn)行再次睪丸免疫接種，并觀測(cè)動(dòng)物的回憶應(yīng)答。副溶血性弧菌抗血清滴度測(cè)定法：血清從1∶20開(kāi)始用生理鹽水做倍比系列稀釋，用試管凝集反應(yīng)檢測(cè)血清中副溶血性弧菌的抗體滴度，同時(shí)附有各反應(yīng)原與生理鹽水對(duì)照，觀測(cè)結(jié)果，出現(xiàn)++以上凝集強(qiáng)度的血清最高稀釋度為該血清的抗體滴度。

1.3 檢測(cè)試劑的制備

1.3.1 SPA菌體試劑的制備 將標(biāo)準(zhǔn)菌株接種于葡萄糖-酵母沁膏-酷蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上。37℃培養(yǎng)18～24 h，用無(wú)菌的0.01 mol/L，pH 7.2 PBS洗下菌苔，制成均勻懸液。3 000 r/min離心20 min，棄上清。用PBS細(xì)菌離心沉淀洗滌2次后，混懸于含0.5%甲醛的PBS內(nèi)，置于室溫3 h。用PBS再離心沉淀洗滌3次后，制成10%細(xì)菌懸液(W/V)。置80℃水浴中加熱20～30 min。用PBS再次離心沉淀洗滌3次后，制成10%SPA菌體試劑，加入0.1%NaN3，4℃保存。

1.3.2 協(xié)同凝集試劑的制備 取10%SPA菌體懸液1 mL，加和特異性抗血清0.1 mL，充分混勻，放37℃ 1 h，然后置4℃冰箱內(nèi)過(guò)夜。3 000 r/min離心20 min，吸出上清。用0.01 mol/L，pH 7.2 PBS離心沉淀洗滌2次后，配成1%抗體致敏的SPA試劑，4℃保存。

1.4 協(xié)同凝集實(shí)驗(yàn)的建立 在潔凈的載玻片上加一小滴生理鹽水，加入少量待檢細(xì)菌制成均勻懸液。加一滴特異性抗體致敏的SPA試劑，充分混合，3 min后觀察結(jié)果。同時(shí)作生理鹽水對(duì)照及用正常兔血清處理的SPA菌體懸液對(duì)照。出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的顆粒狀凝集，液體變清者(++)為陽(yáng)性。5 min后仍無(wú)凝集現(xiàn)象者為陰性。生理鹽水對(duì)照及未致敏SPA菌體對(duì)照應(yīng)為陰性，無(wú)自凝現(xiàn)象發(fā)生。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 VP多抗的鑒定結(jié)果 BTV多抗鑒定濃度為2.75 mg/mL，ELISA效價(jià)為104。

2.2 協(xié)同凝集實(shí)驗(yàn)敏感性檢測(cè)結(jié)果 陽(yáng)性對(duì)照用堿性蛋白胨水倍比稀釋至2.0×106cfu/mL時(shí)仍出現(xiàn)清晰的凝集顆粒。

2.3 協(xié)同凝集實(shí)驗(yàn)特異性檢測(cè)結(jié)果 75份其他腸道桿菌標(biāo)本，其中大腸埃希菌20份，傷寒沙門(mén)菌20份，各取少許菌落接種堿性蛋白胨水37℃增菌6 h，隔水煮沸15 min，冷至室溫后按上法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均為陰性。

2.4 協(xié)同凝集實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果 將菌體試劑置4℃冰箱1年，其對(duì)陽(yáng)性對(duì)照測(cè)定的敏感性基本不變。

2.5 協(xié)同凝集實(shí)驗(yàn)與培養(yǎng)法結(jié)果的比較 112份臨床標(biāo)本，培養(yǎng)法陽(yáng)性64份，協(xié)同凝集法檢測(cè)，62份陽(yáng)性，1份陰性，另1份出現(xiàn)非特異性凝集。培養(yǎng)法陰性48份，協(xié)同凝集法均陰性。與培養(yǎng)法相比較，協(xié)同凝集試驗(yàn)的特異性、敏感性、診斷符合率分別為100%、94.2%、97.3%。

3 討論

本研究從觀察睪丸免疫接種后抗體漲消規(guī)律入手，探討此種免疫法快速制備副溶血性弧菌抗血清的可能性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，4株菌分別首次接種的家兔于7～10 d血清抗體滴度達(dá)到高峰，與俄國(guó)學(xué)者在制備傷寒沙門(mén)氏抗血清的研究所獲得的結(jié)果相似。很顯然，此法具有操作簡(jiǎn)易，免疫次數(shù)少，節(jié)約免疫原，速效等優(yōu)點(diǎn)，是一個(gè)值得推薦的免疫方法。至于睪丸免疫法為何有如此好的結(jié)果，其機(jī)理有待進(jìn)一步研究闡明。

除應(yīng)用甲醛處理的免疫原外，同時(shí)還應(yīng)用了紫外線照射處理的免疫原，以比較二者的免疫效果。曾有學(xué)者指出，甲醛處理細(xì)菌能破壞其表面的蛋白質(zhì)構(gòu)型，損傷免疫

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Objective To develop a simple and rapid method for detecting Vibrio parahaemolyticus.Methods Staphylococcus aureus Cowan I was coated with anti Vibrio parahaemolyticus polyclonal antibodies and a coagglutination test(COA)detecting Vibrio parahaemolyticus in 112 samples was established.Results The detect limit of COA was 2×106cfu/mL,and the detect time was 5 min.When 112 samples were tested,the diagnostic specificity,sensitivity and accuracy of the test,compared with standard culture methods,were 100%、94.2%、97.3%,respectively.Conclusion This study lays a foundation for establishing simple and less time-consuming Vibrio parahaemolyticus Coagglutination Test kit.

Vibrio parahaemolyticus;Coagglutination test;Detection method

1005-619X(2009)08-0680-03原，而紫外線是作用核酸，不損傷細(xì)菌蛋白質(zhì)，所以細(xì)菌的免疫原性較強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果中，雖經(jīng)紫外線處理的副溶血性弧菌獲得了較好的免疫效果，但由于所用動(dòng)物太少，是否優(yōu)于甲醛處理的免疫原，尚需要做更多的試驗(yàn)比較，方能定論。

2009-04-14)

文章編號(hào)：1005-619X(2009)08-0679-02

全軍十一五課題(項(xiàng)目編號(hào)06MB134)

副溶血性弧菌再次免疫家兔后的抗體主要IgG，SPA具有能與特異性抗體IgG的Fc段結(jié)合的特性，結(jié)合后抗體的功能區(qū)暴露在葡萄球菌表面，仍然保持與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合的特性，且以葡萄球菌為載體，可出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集，該法特異、靈敏、簡(jiǎn)便、快速，尤其適合海上艦艇人員感染的初步檢測(cè)。但由于本實(shí)驗(yàn)所檢測(cè)的菌株菌種數(shù)較少，且無(wú)其他致病弧菌做對(duì)照，以及對(duì)臨床標(biāo)本的處理等問(wèn)題仍然需要進(jìn)一步探討完善。