ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)載體超家族與胰腺癌耐藥

劉俊 裘正軍

·綜述·

ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)載體超家族與胰腺癌耐藥

劉俊 裘正軍

雖然吉西他濱(Gemcitabine)是治療胰腺癌的一線化療藥物，較其他傳統(tǒng)的化療藥物有較好的療效，但胰腺癌化療的總體效果仍然不理想[1]。其主要原因是胰腺癌對(duì)多種化療藥物耐藥[2]，而耐藥與ATP結(jié)合盒(ATP-binding cassette，ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)載體超家族有關(guān)[2]。

ABC轉(zhuǎn)運(yùn)載體超家族是一組依賴ATP的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，該家族的每個(gè)成員都具有高度保守的ABC結(jié)構(gòu)，這些蛋白通常利用ATP提供能量轉(zhuǎn)運(yùn)特異的底物。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)載體超家族與很多實(shí)體瘤的原發(fā)性和獲得性耐藥均相關(guān)，而且常常表現(xiàn)為多藥耐藥，相關(guān)的蛋白主要有P-糖蛋白 (p-glycoprotein，P-gp) 、多藥耐藥相關(guān)蛋白 (multidrug resistance associated protein，MRP)、肺耐藥蛋白 (1ung resistance protein, LRP)等?，F(xiàn)就ABC轉(zhuǎn)運(yùn)載體超家族與胰腺癌耐藥的關(guān)系作一綜述。

一、P-糖蛋白(P-gp)

1．P-gp及其編碼基因MDR1：P-gp是一個(gè)由MDR1基因編碼的、相對(duì)分子質(zhì)量為170 000、由1280個(gè)氨基酸組成的的單鏈細(xì)胞膜糖蛋白[3]，與細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有高度同源性。1976年Juliano和Ling[4]首先觀察到具有MDR表型的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞內(nèi)藥物積聚發(fā)生障礙，此耐藥細(xì)胞對(duì)藥物的攝入與親代細(xì)胞無(wú)差異，而藥物外排能力卻明顯增加。此耐藥性的產(chǎn)生是由于細(xì)胞膜P-gp的過(guò)表達(dá)。研究者成功地克隆了P-gp的編碼基因，即MDR1。通過(guò)基因組分析，發(fā)現(xiàn)人類的MDR相關(guān)基因有MDR1和MDR2兩種；鼠有 mdr1、mdr2和mdr3三類。體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)證實(shí)，各分型的功能各不相同，只有鼠的mdrl和mdr3及人MDR1介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的耐藥，鼠的mdr2和人的MDR2不參與耐藥。MDR1 cDNA長(zhǎng)4669 bp，第179～3840 bp為可讀區(qū)，起始密碼為ATG。人與鼠 的MDR1基因序列有高度同源性，兩者區(qū)別集中在氨基端和羧基端的第一個(gè)跨膜區(qū)。此外，人 MDR1基因與細(xì)菌轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因也非常相似，由此推測(cè)MDR基因是一個(gè)高度保守的基因家族。

2．P-gp的分布特點(diǎn)及其生理功能：應(yīng)用原位雜交和免疫組化方法[5]發(fā)現(xiàn)，MDR1基因編碼的P-gp在人類正常組織中有不同程度的表達(dá)，在腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞中MDR1基因的表達(dá)最高；在大腸及小腸上皮細(xì)胞、腎近曲小管、肝細(xì)胞的膽管面、

胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞及大腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞等有中等程度的表達(dá)；在卵巢、胸腺骨髓中，MDR1表達(dá)率很低，甚至不表達(dá)。因此認(rèn)為P-gp并非一種異常蛋白，而具有一定的生理功能，可能與各種保護(hù)屏障有關(guān)。P-gp具有泵功能，正常細(xì)胞可通過(guò)胞膜P-Gp向胞外排出食物中的天然毒物、內(nèi)源性代謝產(chǎn)物和細(xì)胞毒性物質(zhì)。

3．P-gp與胰腺癌：對(duì)于MDR1/P-gp在人類胰腺癌腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)程度是有爭(zhēng)議的。有的學(xué)者[6]認(rèn)為，MDR1和P-gp在大部分胰腺癌中皆有高表達(dá)，而且直接影響到預(yù)后；另外一些學(xué)者則認(rèn)為P-gp在胰腺癌中表達(dá)是缺失的。2000年伯爾尼大學(xué)和美國(guó)加州大學(xué)多學(xué)科學(xué)者合作研究[6]分析了67例胰腺癌患者的手術(shù)切除標(biāo)本及15例生前健康的遺體器官捐獻(xiàn)者胰腺的MDR1和 P-gp表達(dá)。結(jié)果顯示胰腺癌組織MDR1 mRNA表達(dá)水平較正常胰腺組織提高了1.4倍(P=0.03)，MDR1 mRNA呈高表達(dá)的胰腺癌標(biāo)本占癌標(biāo)本的38%，它們的 MDR1 mRNA的水平較正常胰腺則提高了2.9倍(Plt;0.01)。同樣，那些癌組織樣本也高表達(dá)MDR1蛋白。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，MDR1/P-gp高表達(dá)的胰腺癌患者手術(shù)后的生存時(shí)間短于低水平到中等水平表達(dá)者，他們的平均生存時(shí)間分別為11.6個(gè)月(12例)和14.2個(gè)月(42例)。國(guó)內(nèi)研究[7]報(bào)道認(rèn)為，P-gp的陽(yáng)性率在胰腺癌約為70%，而正常胰腺僅為33%，且在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中P-gp的陽(yáng)性率更高，P-gp陽(yáng)性與生存期呈負(fù)相關(guān)。筆者的研究[8-9]顯示，P-gp在胰腺癌組織中高表達(dá)，并與HIF-1α呈正相關(guān)。

4．P-gp與胰腺癌耐藥：2001年加拿大和日本學(xué)者[10]實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，胰腺癌細(xì)胞株SUIT-2的耐藥亞株S-020和TXT(泰索蒂)選擇性SUIT-2細(xì)胞株S2/TXT對(duì)TXT顯著耐藥，對(duì)DOX(阿霉素)交叉耐藥，對(duì)不依賴P-gp的5-FU(5-氟尿嘧啶)不耐藥。RT-PCR提示 MDR1mRNA在亞株S-020和S2/TXT中高表達(dá)，但是在其他胰腺癌細(xì)胞株或亞株中低表達(dá)甚至無(wú)表達(dá)。TXT耐藥性在 S-020和 S2/TXT亞株中可以被P-gp阻滯劑維拉帕米所逆轉(zhuǎn)，提示胰腺癌腫瘤細(xì)胞對(duì)TXT耐藥性，無(wú)論是原發(fā)的還是繼發(fā)的，都有可能受到MDR1(P-gp)的調(diào)控。2003年德國(guó)Nieth等[2]應(yīng)用siRNA沉默人胰腺癌細(xì)胞株EPP85-181RDB的MDR1 mRNA和蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示細(xì)胞株對(duì)daunorubicin的耐藥性下降了85%。提示胰腺癌細(xì)胞對(duì)daunorubicin的耐藥主要通過(guò)MDR1機(jī)制。因此認(rèn)為某些胰腺癌對(duì)某些抗癌藥的耐藥是通過(guò)MDR1/P-gp調(diào)控。在實(shí)驗(yàn)研究方面，1996年美國(guó)內(nèi)布拉斯加州醫(yī)學(xué)中心的研究者[11]應(yīng)用檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的若丹明123(熒光染色標(biāo)記)來(lái)間接測(cè)定4株人類胰腺癌細(xì)胞株(PANC1、BxPC3、AsPC1和Capan1)P-gp的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)表明該4株胰腺癌細(xì)胞株皆未能測(cè)得若丹明123細(xì)胞內(nèi)濃集，同時(shí)，Western blotting檢測(cè)到極少量P-gp，從而認(rèn)為P-gp對(duì)耐藥無(wú)作用。

研究發(fā)現(xiàn)，維拉帕米不僅可以與化療藥物競(jìng)爭(zhēng)細(xì)胞膜上P-gp的結(jié)合位點(diǎn)，而且可在 MDR1基因的轉(zhuǎn)錄水平上抑制P-gp的表達(dá)，抑制P-gp對(duì)細(xì)胞毒藥物的外排，增加腫瘤細(xì)胞內(nèi)化療藥物的濃度，從而逆轉(zhuǎn)其耐藥性。國(guó)內(nèi)學(xué)者[12]的試驗(yàn)初步證明，中等劑量的維拉帕米聯(lián)合化療可部分逆轉(zhuǎn)具有 MDR1表型的人胰腺癌細(xì)胞株對(duì) ADM 和 MMC的耐藥。雖然VRP在體外對(duì)P-gp高表達(dá)的耐藥細(xì)胞株有確切的逆轉(zhuǎn)作用，但其有效濃度(2～6.6 μmol/L)在體內(nèi)具有明顯的心血管毒性。與VRP相比，它的類似物DMDP、ROLL-2933、SDB-乙二 胺和它的R-同分異構(gòu)體的毒性相對(duì)要低一些，它們正在被進(jìn)一步研究。免疫抑制劑環(huán)孢素(CyA)也具有拮抗P-gp的作用，它主要通過(guò)調(diào)節(jié)P-gp的功能而發(fā)揮逆轉(zhuǎn)作用。

二、多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)

MRP由Cole等[13]于1992年發(fā)現(xiàn)，它也是膜結(jié)合蛋白的一員，有12個(gè)跨膜區(qū)，氨基端8個(gè)，羧基端4個(gè)，也有兩個(gè)ATP結(jié)合位點(diǎn)，相對(duì)分子質(zhì)量為170 000。MRP與 P-gp在氨基酸序列上有14%的同源性，同源序列集中于ATP結(jié)合區(qū)。但編碼MRP及P-gp的基因來(lái)源相距甚遠(yuǎn)[14]。MRP在正常組織中表達(dá)情況與P-gp相近，主要位于胞質(zhì)膜。MRP還存在于細(xì)胞核，能引起某些底物從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和再分布[15]。P-gp和MRP都屬于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABC超家族，它們介導(dǎo)的耐藥主要都是依賴能量的外排發(fā)揮作用，但它們之間還存在一些差異。MRP介導(dǎo)的耐藥性低于P-gp，MRP表達(dá)介導(dǎo)的耐藥是通過(guò)改變細(xì)胞內(nèi)藥物的重新分布，而不影響細(xì)胞內(nèi)藥物總的蓄積量，MRP引起的 MDR不能被異搏定和環(huán)胞素逆轉(zhuǎn)。

1996年美國(guó)內(nèi)布拉斯加州醫(yī)學(xué)中心的研究者[11]采用檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的長(zhǎng)春新堿的濃度來(lái)間接測(cè)定4種人類胰腺癌細(xì)胞株(PANC1、BxPC3、AsPC1和Capan1) MRP的表達(dá)。結(jié)果表明，4種胰腺癌細(xì)胞株在環(huán)孢素或維拉帕米干預(yù)后都顯示出相應(yīng)的長(zhǎng)春新堿濃度升高，證明了MRP在其中的作用。Western blotting也檢測(cè)到細(xì)胞表達(dá)MRP蛋白，從一個(gè)側(cè)面提示胰腺癌細(xì)胞固有的MDR與MRP之間也可能存在著密切的關(guān)系。有研究證明[16]，MRP與GST-n的表達(dá)具有相關(guān)性，提示惡性腫瘤耐藥的調(diào)控可能存在共同的誘導(dǎo)機(jī)制。但2001年加拿大和日本學(xué)者[10]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MRP雖在SUIT-2亞株和其他的細(xì)胞株有一定程度的表達(dá)，對(duì)于TXT 耐藥不存在特異性相關(guān)，但MRP特異調(diào)節(jié)劑吲哚美辛不能逆轉(zhuǎn)S-020和 S2/TXT亞株的TXT耐藥性，提示胰腺癌對(duì)TXT的耐藥與MRP 的MDR機(jī)制不相關(guān)。Miller等[11]報(bào)道，MRP功能性抑制劑Pluromc block copolymers對(duì)胰腺癌耐藥有很好的逆轉(zhuǎn)作用。

三、肺耐藥蛋白(LRP)

LRP是1993年由Scheper發(fā)現(xiàn)并命名的相對(duì)分子質(zhì)量為110 000的糖蛋白。與上述兩種蛋白相比，其缺少跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域，缺少像 MRP和P-gp所特有的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的ATP結(jié)合位點(diǎn)。通過(guò)比較序列分析，LRP與穹隆蛋白高度同源，介導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中各種物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)。LRP mRNA及蛋白表達(dá)主要分布于正常或異常導(dǎo)管上皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)。LRP在正常組織中也有表達(dá)。正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞低表達(dá)LRP蛋白，胰島及細(xì)胞間質(zhì)均無(wú)表達(dá)，提示胰腺組織為 LRP低表達(dá)器官，LRP在胰腺外分泌器官的表達(dá)與其解毒功能有關(guān)。

研究表明，實(shí)體瘤中LRP表達(dá)與臨床預(yù)后有關(guān)，LRP高表達(dá)者預(yù)后較差。在胰腺癌組織中LRP表達(dá)呈現(xiàn)點(diǎn)灶狀或片狀分布，染色程度重。Izquierdo等[17]報(bào)道，高分化胰腺癌組織LRP表達(dá)顯著高于低分化癌組織LRP表達(dá)。孫誠(chéng)誼等[18]的研究表明，LRP與胰腺癌的病理分級(jí)和TNM分期有關(guān)。高分化、TNM Ⅰ與Ⅱ期腫瘤患者LRP表達(dá)顯著高于低分化、TNMⅢ與Ⅳ期患者；LRP高表達(dá)與患者較長(zhǎng)的術(shù)后生存期有關(guān)；LRP表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤部位、大小無(wú)關(guān)。將 LRP的cDNA轉(zhuǎn)染敏感細(xì)胞并未產(chǎn)生耐藥細(xì)胞的表型，表明LRP可能與其他分子共同影響藥物的分布，但單獨(dú)不能產(chǎn)生MDR狀態(tài)。

四、結(jié)語(yǔ)

ABC轉(zhuǎn)運(yùn)載體超家族的不同蛋白在不同的胰腺癌細(xì)胞中表達(dá)量不同，在胰腺癌耐藥中的作用也各有不同。P-gp高表達(dá)的胰腺癌對(duì)某些化療藥物如TXT、daunorubicin耐藥。拮抗P-gp的表達(dá)能逆轉(zhuǎn)胰腺癌細(xì)胞株對(duì)ADM和MMC的耐藥現(xiàn)象。MRP在胰腺癌的耐藥中起一定的作用，其胰腺癌耐藥的機(jī)制與P-gp不同。胰腺癌中LRP高表達(dá)可能與高分化、腫瘤早期以及術(shù)后長(zhǎng)期生存有關(guān)，而與胰腺癌耐藥關(guān)系不大。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)載體超家族與胰腺癌耐藥的關(guān)系需要進(jìn)一步的研究。

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2008-11-13)

(本文編輯：呂芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.06.027

200080 上海,上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院,上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院普外科

劉俊，Email:liujum@yahoo.com.cn