雷公藤甲素對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株HHUA體外抑制作用的研究

蔡 玉， 孫志華， 吳 強， 仲 劍

中藥雷公藤用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腎炎等免疫性疾病已有上千年歷史。近年來文獻(xiàn)報道其提取物雷公藤甲素對多種腫瘤細(xì)胞有明顯的細(xì)胞毒活性，并可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，具有廣譜抗腫瘤效應(yīng)，在腫瘤治療方面的應(yīng)用日益受到

人們的關(guān)注。但在其對人子宮內(nèi)膜癌HHUA細(xì)胞株的作用的研究方面，國內(nèi)外尚未見相關(guān)報道。故本研究主要觀察雷公藤甲素對體外培養(yǎng)的人類子宮內(nèi)膜癌HHUA細(xì)胞株生長增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞株HHUA受贈于山東大學(xué)山東省立醫(yī)院，雷公藤甲素購自中國藥品生物制品檢定所，純度≥98%，用二甲基亞砜(DMSO)配制成1 g/L儲備液，0.22 μm的濾器過濾除菌，-20℃保存，臨用前用無血清培養(yǎng)液稀釋成所需濃度；試劑分別購自相關(guān)公司，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)和DMSO 購于Amersco公司，細(xì)胞培養(yǎng)基1640購于Hyclone公司，胎牛血清購于杭州四季青公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HHUA細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的1640培養(yǎng)液中，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3天傳代1次,細(xì)胞呈單層貼壁生長。

1.2.2 MTT法檢測細(xì)胞增殖能力 取2×104/mL的HHUA細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，置37℃ ，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，更換培養(yǎng)液后加上各種濃度的雷公藤甲素，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h。終止培養(yǎng)前加MTT(5 g/L)，每孔20 μL，37℃再培養(yǎng)4 h，吸出上清液,加 DMSO 150 μL/孔，振蕩至紫色結(jié)晶完全消失，然后在酶標(biāo)儀上490 nm處測定吸光度值。按下列公式計算細(xì)胞增殖抑制率：細(xì)胞增殖抑制率(%)=[1-(實驗組A值-空白對照孔A值)/(陰性對照組A值-空白對照孔A值)]×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期與凋亡樣本的處理 以雷公藤甲素(10、20、40、80、160 ng/mL)處理HHUA細(xì)胞，同時用培養(yǎng)液和相應(yīng)濃度的DMSO作對照組，培養(yǎng)48 h后終止實驗，收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，4℃、體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇固定過夜。PBS洗滌2次，碘化丙啶(PI)染色，4℃避光30 min后上機檢測，計算各期細(xì)胞所占比例，G1峰前面出現(xiàn)的亞2倍體峰即為凋亡細(xì)胞峰。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 雷公藤甲素對子宮內(nèi)膜癌HHUA細(xì)胞增殖的抑制作用

不同濃度雷公藤甲素對HHUA細(xì)胞作用24、48、72 h的增殖抑制率。雷公藤甲素對HHUA細(xì)胞的生長抑制作用呈劑量時間依賴性。實驗組與對照組進(jìn)行比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。24 h、48 h 及72 h的IC50值分別為177.0 ng/mL、93.2 ng/mL、43.4 ng/mL(圖1)。

圖1 雷公藤甲素對人子宮內(nèi)膜癌HHUA細(xì)胞增殖抑制作用

2.2 流式細(xì)胞儀檢測雷公藤甲素對HHUA細(xì)胞周期分布的影響

不同濃度雷公藤甲素作用于腫瘤細(xì)胞48 h后，與對照組相比，隨著藥物濃度的增加，在S期的細(xì)胞比例逐漸增大，其中40 ng/mL組和80 ng/mL 組與對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

表1 流式細(xì)胞儀分析雷公藤甲素對HHUA細(xì)胞周期分布的影響

*與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)

2.3 流式細(xì)胞儀檢測雷公藤甲素對HHUA細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示：未經(jīng)雷公藤甲素處理的HHUA細(xì)胞無明顯凋亡峰。而經(jīng)雷公藤甲素(40 ng/mL、80 ng/mL、160 ng/mL)處理48 h后，在G1期前出現(xiàn)明顯的凋亡峰，細(xì)胞凋亡率分別為16.01%、17.05%、63.85%(圖2)。

A：未處理對照細(xì)胞；B～D：雷公藤甲素(40、80、160 ng/mL)處理48 h細(xì)胞圖2 流式細(xì)胞儀分析雷公藤甲素對HHUA細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖器官最常見的惡性腫瘤之一，占女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的20%～30%。在過去的20～30年里，由于生活水平的提高及不當(dāng)?shù)募に靥娲委煹仍?，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率呈明顯上升趨勢[1]。雷公藤甲素是一種從雷公藤中提取到的主要活性物質(zhì)，系一種環(huán)氧二萜單體成分。近年來，大量的體內(nèi)外實驗研究表明雷公藤甲素對如白血病、宮頸癌、卵巢癌、肺癌、胰腺癌等多種腫瘤有抑制作用[2-7]，但用于子宮內(nèi)膜癌治療方面的研究尚不多見。本實驗研究雷公藤甲素對人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株HHUA的作用，探討臨床應(yīng)用雷公藤甲素治療子宮內(nèi)膜癌的可行性。

本實驗觀察了不同濃度的雷公藤甲素對人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株HHUA的生長抑制情況，并與未經(jīng)雷公藤甲素處理的對照組進(jìn)行對比。發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素對HHUA細(xì)胞的生長有明顯抑制作用，并且在一定的濃度范圍內(nèi)隨藥物濃度和作用時間的延長，抑制作用也顯著增加。作用72 h時，5 ng/mL雷公藤甲素即可抑制HHUA細(xì)胞的增殖；隨著濃度的增加，雷公藤甲素對細(xì)胞的抑制作用呈線性增長。這與雷公藤甲素抑制多種腫瘤細(xì)胞的作用一致[2-5]。雷公藤甲素作用24、48、72 h的IC50值分別為177.0 ng/mL、93.2 ng/mL和43.4 ng/mL，提示臨床應(yīng)用可采用減小劑量并延長用藥時間的方法達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用，并可減少藥物的毒副反應(yīng)。

細(xì)胞凋亡在腫瘤的發(fā)生機制中具有重要的意義，是細(xì)胞在一定的病理或生理條件下，由基因調(diào)控的主動而有序的自我消亡過程，是一種不同于細(xì)胞壞死的細(xì)胞死亡形式。以往研究證實，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與腫瘤細(xì)胞失控性增殖和凋亡減少有關(guān)，抗腫瘤藥物可以通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而抑制腫瘤生長。雷公藤甲素(40 ng/mL、80 ng/mL、160 ng/mL)處理HHUA細(xì)胞48 h后，在G1期前出現(xiàn)明顯的凋亡峰，細(xì)胞凋亡率分別為16.01%、17.05%、63.85%，具有劑量依賴性。并且，隨著藥物濃度增加，S期細(xì)胞增多，G2/M期細(xì)胞減少，40 ng/mL及80 ng/mL的雷公藤甲素將HHUA細(xì)胞周期阻滯在S期，這與其他作者的相關(guān)研究一致[3-4]。倒置顯微鏡下可見隨著藥物劑量的增加，死亡的變圓漂浮的細(xì)胞亦逐漸增多。以上數(shù)據(jù)表明雷公藤甲素可能通過干擾細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而抑制腫瘤細(xì)胞的生長。

本研究顯示，雷公藤甲素對人子宮內(nèi)膜癌HHUA細(xì)胞的生長有抑制作用，其作用機制表現(xiàn)為阻滯腫瘤細(xì)胞于DNA合成期，并導(dǎo)致一定數(shù)量的細(xì)胞凋亡。雷公藤甲素通過何種途徑誘導(dǎo)HHUA細(xì)胞凋亡將是下一步的研究方向。通過體內(nèi)實驗，建立動物模型，進(jìn)一步研究雷公藤甲素的抗腫瘤作用及毒副作用，為其臨床應(yīng)用打下一定基礎(chǔ)。

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