低溫對樟樹抗寒性生理指標(biāo)的影響

王 寧，袁美麗，安瑞云

(1.河南科技大學(xué)林學(xué)院，河南 洛陽 471023；2.洛陽市隋唐城遺址植物園，河南 洛陽 471002)

低溫是影響植物區(qū)域性分布的重要限制因素[1-3]。輕度低溫脅迫會影響植物葉、莖等形態(tài)指標(biāo)以及生物量的變化，而嚴(yán)重低溫會引起植物新陳代謝紊亂甚至導(dǎo)致植株死亡[4-5]。光合作用是植物生長發(fā)育的基礎(chǔ)，也是植物對低溫較為敏感的生理過程之一。葉綠素?zé)晒饽芴綔y植物葉片的光合能力及熱耗散情況，因此環(huán)境變化對植物光合過程的影響可通過葉綠素?zé)晒馓匦詠矸从砙6]。與常見植物抗逆性研究中利用的電導(dǎo)法、組織褐變法和氯化三苯基四氮唑(triphenyl tetrazolium chloride, TTC)還原法相比，葉綠素?zé)晒夥治黾夹g(shù)不僅具有快速、靈敏的特性，更重要的是可無損傷的探測逆境條件下完整植株的光合作用情況，因此被廣泛應(yīng)用于植物光合結(jié)構(gòu)功能及其對環(huán)境脅迫適應(yīng)性的評價研究[7]。

樟[Cinnamomumcamphora(L.) J. Presl]是珍貴的經(jīng)濟(jì)樹種,根據(jù)其樟油化學(xué)成分不同，可分本樟(camphor-type)(含樟腦為主)，芳樟(linalool-type)(含芳樟醇為主)和油樟(terpineol-type)(含松油醇為主)3個類型。我國北方地區(qū)的常綠闊葉樹種相對匱乏，開展樟屬植物抗寒性研究，可為樟樹耐寒品種選育及北方地區(qū)常綠闊葉樹種的引種應(yīng)用提供參考。目前，已有從葉片解剖結(jié)構(gòu)[8-9]及SOD等生理生化指標(biāo)方面[10]對多種樟樹的抗寒性進(jìn)行了研究，并對自然降溫過程中猴樟(C.bodinieriLévl)和芳樟[C.camphora(linalool-type)]的葉綠素?zé)晒鈪?shù)變化進(jìn)行了探討[11]，但通過人工設(shè)置低溫結(jié)合葉綠素?zé)晒夥治黾夹g(shù)進(jìn)行不同種樟樹的抗寒性研究尚未見有報道。為此，通過人工模擬低溫環(huán)境，從葉綠素、抗氧化酶系統(tǒng)、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)以及葉綠素?zé)晒鈪?shù)等方面，比較芳樟和油樟[C.camphora(terpineol-type)]抗寒性強弱，旨在為耐寒樟樹品種選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為1 年生實生油樟和芳樟幼苗，種子均來源于湖南省長沙縣跳馬鎮(zhèn)。試驗地位于河南省鄭州市河南農(nóng)業(yè)大學(xué)第三生活區(qū)，北緯34°16′，東經(jīng)112°42′，屬北溫帶大陸性季風(fēng)氣候，年均氣溫15.6 ℃，1月份最冷，月平均氣溫2.15 ℃，年均降雨量649.9 mm。2018年8月，選擇生長健康的植株移栽至花盆內(nèi)(盆口直徑25 cm，高30 cm)，1株 · 盆-1，盆土為沙壤土。緩苗1周后進(jìn)行常規(guī)日常管理。

1.2 研究方法

1.2.1 低溫脅迫 2018年8月15日，選擇長勢良好、大小相近的2種樟樹幼苗各60盆，移入人工氣候室(浙江大學(xué)電器設(shè)備廠)，于20 ℃、光照12 h· d-1的條件下培養(yǎng)5 d。之后，設(shè)置降溫速度為2 ℃· h-1，分別降溫到0、6、12 ℃，并低溫脅迫0(CK)、2、4、6 d進(jìn)行抗寒指標(biāo)的測定。

1.2.2 指標(biāo)測定 利用便攜式調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨xMini-PAM(德國Walz公司)進(jìn)行葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定。每盆選取植株下部成熟葉2片，每處理測定5株。首先，用暗適應(yīng)葉夾處理待測葉片，暗適應(yīng)30 min，獲取初始熒光(F0)、最大熒光(Fm)。并求出光系統(tǒng)Ⅱ(photosystem Ⅱ，PSⅡ)最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)，F(xiàn)v/Fm=(Fm-F0)/Fm。

每處理隨機(jī)選取3盆植株，每株選取3片健康成熟的功能葉片進(jìn)行生理指標(biāo)的測定。采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%乙醇法測定葉綠素(chlorophyll，Chl)含量；酸性茚三酮法測定脯氨酸(proline，Pro)含量；氮藍(lán)四唑光還原法測超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性；硫代巴比妥酸法測定丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量；電導(dǎo)法測定相對電導(dǎo)率(relative conductivity，REC)[12]。

1.2.3 耐寒性評價 利用模糊隸屬函數(shù)法[13-15]對2種樟樹葉綠素?zé)晒鈪?shù)及生理指標(biāo)進(jìn)行分析，計算每項指標(biāo)的隸屬值，公式如下:

f(xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(1)

f(xi)=1-(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(2)

式中：Xi為指標(biāo)測定值，Xmax、Xmin分別為該指標(biāo)的最大值和最小值。若某一指標(biāo)性狀與抗寒性呈正相關(guān)，選用公式(1)，若呈負(fù)相關(guān)則用公式(2)。根據(jù)上述公式計算每一指標(biāo)在不同低溫脅迫下的隸屬值，最后把同一樹種各項耐寒指標(biāo)隸屬函數(shù)值累加，取平均值為綜合評價值(D)，D值越大，耐寒性越強。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

使用SPSS 18.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對2種樟樹抗寒生理指標(biāo)的影響

2.1.1 葉綠素含量 隨脅迫時間的延長，不同低溫處理下油樟和芳樟的葉綠素含量整體均呈下降的趨勢(表1)。其中，6和12 ℃條件下，處理2、4和6 d，2種樟樹的葉綠素含量與CK相比差異均不顯著；0 ℃條件下6 d時，油樟和芳樟的葉綠素含量分別較CK下降了17.38%和33.33%，其中，油樟的葉綠素含量與CK差異不顯著，而芳樟則與CK差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。由此說明，0 ℃條件下連續(xù)6 d的低溫脅迫已對芳樟的葉綠素合成及降解或葉綠體結(jié)構(gòu)造成了一定的負(fù)面影響。

表1 低溫脅迫對2種樟樹葉綠素含量的影響Table 1 Effect of low temperature on chlorophyll content in the leaves of the two camphor species

2.1.2 超氧化物歧化酶活性 從表2可看出，不同低溫處理下，2種樟樹的SOD活性均隨脅迫時間的延長呈持續(xù)增加的趨勢，表明2種樟樹的SOD活性均參與了其低溫脅迫的響應(yīng)過程。與CK相比，至第6天時，6和12 ℃條件下2種樟樹的SOD活性增加均未達(dá)到顯著水平；0 ℃條件下至第6天時，油樟的SOD活性與CK差異顯著(P<0.05)，而芳樟則未達(dá)到差異顯著水平，此外，至第6天時，油樟SOD活性的增幅為38.10%，明顯大于芳樟的30.35%。由此表明，油樟通過增加SOD活性清除由于低溫脅迫所產(chǎn)生活性氧自由基的能力大于芳樟。

表2 低溫脅迫對2種樟樹SOD活性的影響Table 2 Effect of low temperature on SOD activity in the leaves of the two camphor species

2.1.3 丙二醛含量 不同低溫處理下，2種樟樹的MDA含量均隨脅迫時間的延長而呈持續(xù)增加的趨勢(表3)。其中，6和12 ℃條件下，2、4和6 d時，2種樟樹的MDA含量與CK相比差異均不顯著；0 ℃條件下至第6天時，油樟和芳樟的MDA含量分別較CK增加了26.06%和63.03%，其中，芳樟MDA含量與CK差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)，而油樟的MDA含量與CK差異不顯著。由此表明，連續(xù)6 d的0 ℃低溫脅迫已一定程度地造成了芳樟葉片細(xì)胞膜質(zhì)過氧化損傷。

2.1.4 相對電導(dǎo)率 隨脅迫時間的延長，不同低溫處理下2種樟樹的相對電導(dǎo)率均呈逐漸增加的趨勢(表4)。其中，12 ℃條件下，2、4和6 d時，油樟和芳樟的相對電導(dǎo)率與CK差異均不顯著；6 ℃條件下，2、4和6 d時，油樟相對電導(dǎo)率與CK差異不顯著，而第6天芳樟則達(dá)到差異顯著水平(P<0.05)；0 ℃條件下，油樟在脅迫至第6天時與CK差異顯著，而芳樟則在第4天時與CK差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。結(jié)果表明，低溫對2種樟樹葉片細(xì)胞膜透性造成了一定影響，隨處理溫度的下降及脅迫時間的延長，電解質(zhì)的外滲呈逐漸增加的變化，但2種樟樹間又存在一定的差異，這可能與它們的低溫適應(yīng)能力不同有關(guān)。

表3 低溫脅迫對2種樟樹MDA含量的影響Table 3 Effect of low temperature on MDA content in the leaves of the two camphor species

表4 低溫脅迫對2種樟樹相對電導(dǎo)率的影響Table 4 Effect of low temperature on relative conductivity in the leaves of the two camphor species

2.1.5 脯氨酸含量 隨脅迫時間的延長，不同低溫處理下油樟和芳樟葉片內(nèi)脯氨酸含量均呈持續(xù)增加的趨勢(表5)。但直至脅迫6 d時，0、6及12 ℃處理下2種樟樹脯氨酸含量與CK差異均未達(dá)到顯著水平。其中，0 ℃條件下脅迫至6 d時，油樟脯氨酸含量較CK增加了22.65%，高于芳樟的22.18%。

表5 低溫脅迫對2種樟樹脯氨酸含量的影響Table 5 Effect of low temperature on proline content in the leaves of the two camphor species

2.2 低溫脅迫對2種樟樹葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

2.2.1 初始熒光(F0) 從表6可看出，12 ℃條件下，2種樟樹的F0均呈先降后升的趨勢，而0和6 ℃條件下，則均呈持續(xù)增加的變化。其中，12 ℃條件下至第6天時，油樟和芳樟的F0與CK差異均不顯著；6 ℃條件下，油樟F0在第6天與CK差異不顯著，而芳樟則是在脅迫的第6天與CK差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)；0 ℃條件下，油樟和芳樟F0分別在脅迫的第6天及第4天時與CK差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)，至第6天時，分別較CK增加了29.69%、59.60%。由此表明，12 ℃條件下短時間的低溫脅迫并未對2種樟樹PSⅡ反映中心造成傷害，F(xiàn)0的降低可能是PSⅡ的熱耗散增加所致，之后，隨著脅迫溫度下降及時間延長，F(xiàn)0均呈持續(xù)增加的變化，表明低溫脅迫已對PSⅡ反映中心造成了一定的傷害。

2.2.2 最大光化學(xué)效率(Fv/Fm) 隨脅迫時間的延長，不同低溫處理下2種樟樹Fv/Fm呈持續(xù)下降的趨勢(表7)。其中，6和12 ℃條件下至第6天時，油樟和芳樟的Fv/Fm與CK差異均不顯著；0 ℃條件下至第6天時，油樟的Fv/Fm與CK差異不顯著，而芳樟則達(dá)到差異顯著水平(P<0.05)。

表6 低溫脅迫對2種樟樹初始熒光(F0)的影響Table 6 Effect of low temperature on initial fluorescence in the leaves of the two camphor species

表7 低溫脅迫對2種樟樹最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)的影響Table 7 Effect of low temperature on maximum photochemical efficiency of PSⅡ in the leaves of the two camphor species

2.3 耐寒性綜合評價

利用隸屬函數(shù)法求出油樟和芳樟葉綠素含量、相對電導(dǎo)率、脯氨酸、MDA含量以及Fv/Fm等7個指標(biāo)的隸屬值，累加后得出每種樟樹的平均隸屬值，即綜合評價值(D)，D值越大則耐寒性越強。根據(jù)綜合評價值可知(表8)，油樟的耐寒性大于芳樟。

表8 低溫脅迫下2種樟樹個指標(biāo)隸屬函數(shù)值、綜合評價值及排序Table 8 Subjective function value, comprehensive evaluation value(D), and order of the two camphor species under cold stress

3 討論與結(jié)論

低溫會導(dǎo)致葉綠體的降解，并抑制葉綠素的合成，因此葉綠素含量的穩(wěn)定性一定程度上反映了低溫脅迫對植物的傷害程度[16-18]。本研究中，隨脅迫時間的延長，不同低溫條件下2種樟樹的葉綠素含量呈逐漸下降的變化趨勢，表明低溫脅迫對其葉綠素的合成及降解產(chǎn)生了一定的影響。但僅在0 ℃條件下脅迫至第6天時，芳樟葉綠素含量較CK下降達(dá)到顯著水平(P<0.05)，由此表明，與芳樟相比，相同低溫條件下油樟依然可保持相對穩(wěn)定的葉綠素含量，從而有利于其光合作用，達(dá)到減輕低溫脅迫對其造成的傷害。

相對電導(dǎo)率的改變反映了細(xì)胞膜透性的變化，逆境條件下植物細(xì)胞膜透性增大，細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)外滲增加，造成電導(dǎo)率的增大[19-21]。MDA作為膜質(zhì)過氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，其含量成為膜質(zhì)受傷害程度的重要反映指標(biāo)。CAMPOSetal[22]認(rèn)為MDA的含量反映了膜質(zhì)過氧化水平，以及細(xì)胞膜受損程度和植物逆境脅迫的抵御能力。而SOD作為植物體內(nèi)重要的活性氧自由基清除酶，其活性大小與植物的抗氧化脅迫能力呈正相關(guān)，因此MDA含量及SOD活性常被作為植物抗逆性的重要評價指標(biāo)[23]。本研究中，2種樟樹的相對電導(dǎo)率隨脅迫溫度的下降及處理時間的延長均呈持續(xù)增加的變化，表明低溫脅迫導(dǎo)致了二者葉片細(xì)胞膜透性的逐漸增大。此外，6 ℃條件下至第6天時，芳樟相對電導(dǎo)率與CK差異顯著，而油樟差異不顯著；0 ℃條件下，油樟和芳樟分別在第6天及第4天時與CK差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。此外，2種樟樹的MDA含量及SOD活性均隨處理溫度降低及脅迫時間延長呈持續(xù)增加的變化。且0 ℃條件下至第6天時，芳樟的MDA含量較CK增加顯著(P<0.05)，且此脅迫條件下油樟的SOD活性較CK增加顯著(P<0.05)，而芳樟則不顯著，且油樟SOD活性大于芳樟。由此表明，芳樟SOD保護(hù)酶對低溫脅迫產(chǎn)生的活性氧自由基清除能力小于油樟，致使其膜質(zhì)過氧化水平大于油樟，從而造成其受低溫脅迫程度的增大。

逆境條件下，植物通過增加體內(nèi)脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量維持細(xì)胞的膨脹狀態(tài)，從而達(dá)到降低水勢和保持某些生物大分子活性以減輕植物細(xì)胞的脅迫損傷[24]。本研究中，低溫脅迫中油樟和芳樟的脯氨酸含量均呈持續(xù)增加的變化，表明2種樟樹均通過脯氨酸含量的增加抵御外界低溫的持續(xù)脅迫。與芳樟相比，相同條件下油樟脯氨酸含量增加更為明顯，這可能與其耐寒性較強有關(guān)。

初始熒光(F0)由PSⅡ捕光葉綠素蛋白復(fù)合物發(fā)出，一般情況下，數(shù)值保持穩(wěn)定，當(dāng)光合機(jī)構(gòu)受到破壞時則會升高[25]。Fv/Fm值的大小可反映PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)換效率的高低，因此常被用于植物的抗逆性研究。Fv/Fm值降低表明植物受到光抑制，低溫脅迫下變化幅度越小表明植物耐低溫能力越強[26]。本研究中，12 ℃條件下油樟和芳樟的F0呈先升后降的變化，而Fv/Fm則均呈下降的變化，但至第6天時，F(xiàn)0和Fv/Fm與CK差異均不顯著，表明12 ℃的低溫雖然影響了2種樟樹的正常光合作用過程，使PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)化效率短暫下降，但潛在活性中心并未受損。之后，油樟F0和Fv/Fm在0 ℃條件下至第6天時與CK差異達(dá)到顯著水平；而芳樟則分別在6 ℃條件下至第6天時及0 ℃條件下至第4天時與CK差異達(dá)到顯著水平。由此可知，相同條件下2種樟樹的PSⅡ反應(yīng)中心受低溫脅迫的損傷程度因其耐寒性不同而存在一定差異，其中又以油樟對同等低溫脅迫的適應(yīng)能力較強。

植物的抗寒性是受多因素共同影響的復(fù)雜生理過程，而隸屬函數(shù)分析則是在多指標(biāo)測定基礎(chǔ)上，對植物耐寒性進(jìn)行綜合評價的簡單且有效地方法，且可避免使用某單一指標(biāo)進(jìn)行評價而造成的片面性，因此，隸屬函數(shù)法作為有效的評價方法被廣泛應(yīng)用于如核桃[27]、板栗[28]等植物的抗寒性評價研究。本研究依據(jù)隸屬函數(shù)法計算了與樟樹耐寒性關(guān)系密切的SOD、MDA以及F0、Fv/Fm等7個指標(biāo)的平均隸屬度，對2種樟樹耐寒性進(jìn)行了綜合評價分析，表明油樟的耐寒性大于芳樟。本研究僅在室內(nèi)條件下，從不同低溫及持續(xù)時間兩方面，結(jié)合生理生化指標(biāo)的測定證實了油樟耐寒性大于芳樟，而北方地區(qū)的冬季低溫不僅有極端最低溫，還包括驟然降溫及升溫等多種情況，因此不同種樟樹在北方地區(qū)的引種應(yīng)用還需更深一步的研究。