血卟啉衍生物光動力治療人胰腺癌細胞的實驗研究

于鐘 黃開紅 王凌云 朱兆華 陳汝福 張晉昕

·論著·

血卟啉衍生物光動力治療人胰腺癌細胞的實驗研究

于鐘 黃開紅 王凌云 朱兆華 陳汝福 張晉昕

目的研究血卟啉衍生物光動力治療(photodynamic therapy, PDT)對體外培養(yǎng)的人胰腺癌細胞株P(guān)ANC1的殺傷效應(yīng)及其規(guī)律。方法以Biolitec PDT 630半導(dǎo)體激光治療儀為光源，用不同濃度的血卟啉衍生物Photosan(0.5、1、2、4 mg/L)作為光敏劑孵育PANC1細胞8 h后，分別給予不同劑量(1、5、10 J/cm2)630 nm激光照射，用MTT法測定PDT后各組的A492值，以流式細胞儀測定10 J/cm2光照后細胞凋亡情況。結(jié)果不加光敏劑Photosan或不進行光照，對細胞均無殺傷效應(yīng)；添加1 mg/L Photosan時，10 J/cm2的光照對細胞產(chǎn)生殺傷效應(yīng)(0.140±0.013對0.213±0.008，P<0.05)；添加2 mg/L Photosan時，5 J/cm2和10 J/cm2的光照對細胞產(chǎn)生殺傷效應(yīng)(0.081±0.024和0.049±0.013對0.211±0.031，P<0.05和P<0.01)；添加4 mg/L Photosan時，所有光照劑量均對細胞產(chǎn)生明顯的殺傷效應(yīng)。但5 J/cm2與10 J/cm2光照對細胞的殺傷效應(yīng)無顯著差異。用10 J/cm2光照，0、2、4 mg/L Photosan時的細胞凋亡率分別為(13.8±1.8)%、(40.9±1.6)%、(62.5±2.0)%，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論單純給予光敏劑或光照對PANC1均不產(chǎn)生PDT效應(yīng)。光敏劑達到一定濃度，光照達到一定劑量后，PDT效應(yīng)隨其增加而增強。

胰腺腫瘤； 光動力療法； 血卟啉衍生物； 細胞系

光動力治療(photodynamic therapy，PDT)是利用光敏劑在特定波長激光照射下產(chǎn)生的光化學(xué)反應(yīng)治療腫瘤的新技術(shù)[1-2]。目前臨床主要限于體表、呼吸道和消化道腔內(nèi)腫瘤的治療。近年來由于內(nèi)鏡和超聲技術(shù)的進步使PDT治療深部臟器腫瘤成為可能。本實驗以人胰腺癌細胞系PANC1為對象,應(yīng)用血卟啉衍生物光敏劑，觀察PDT對其的殺傷效應(yīng)，并初步探討其機制。

材料與方法

一、MTT 法測定細胞的存活

人胰腺癌細胞株P(guān)ANC1由中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院凍存，常規(guī)培養(yǎng)傳代。取4×103個對數(shù)生長期的PANC1細胞接種于96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)液，每孔分別加入當(dāng)天用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋的0.5、1、2、4 mg/L的Photosan(德國SeeLab公司，批號940601)溶液100 μl，避光繼續(xù)培養(yǎng)8 h。棄Photosan的培養(yǎng)液，加入新鮮培養(yǎng)液100 μl/孔后立即給予激光照射，波長630 nm，光照能量為1、5、10 J/cm2，光斑直徑為5 cm，光照時間為7 min。每組均設(shè)3個復(fù)孔。同時設(shè)單純光敏劑組、單純光照組及空白組。光照后繼續(xù)培養(yǎng)細胞24 h。每孔加入5 mg/ml MTT溶液20 μl，繼續(xù)孵育4 h，棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清，加100 μl DMSO，恒溫振蕩10 min。用酶標(biāo)儀檢測各組A492值，取均值。A492值間接反映活細胞數(shù)量，并與其成正比。

二、流式細胞術(shù)測定細胞凋亡

取對數(shù)生長期的PANC1細胞，在3個直徑5 cm培養(yǎng)皿各接種2×105個細胞培養(yǎng)24 h。棄培養(yǎng)液，分別加入0、2、4 mg/L濃度的Photosan溶液5 ml，避光繼續(xù)培養(yǎng)8 h。吸出含Photosan的培養(yǎng)液，加入新鮮培養(yǎng)液5 ml，給予10 J/cm2激光照射，光斑直徑為5 cm，光照時間為7 min。照光后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，胰酶消化，離心收集細胞，PBS洗滌3次后將細胞重懸于200 μl 結(jié)合緩沖液，加入10 μl Annexin-v-FITC和5 μl PI，混勻后避光室溫反應(yīng)15 min，加入300 μl緩沖液，上流式細胞儀檢測。實驗重復(fù)3次。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、PDT對PANC1細胞的殺傷效應(yīng)

不加光敏劑Photosan或不進行光照，對細胞均無殺傷效應(yīng)。添加0.5 mg/L Photosan時，不同光照劑量對細胞的殺傷無顯著變化；添加1 mg/L Photosan時，10 J/cm2的光照對細胞的殺傷效應(yīng)較0、1、5 J/cm2光照劑量顯著增加(P<0.05)；添加2 mg/L Photosan時，5 J/cm2和10 J/cm2的光照對細胞的殺傷效應(yīng)較1 J/cm2光照劑量顯著增加(P<0.05)；添加4 mg/L Photosan時，所有光照劑量均對細胞產(chǎn)生明顯的殺傷效應(yīng)(P<0.01，表1)。Photosan濃度和光照劑量之間既存在交互作用(P<0.05)，又存在獨立效應(yīng)(P<0.05)。但10 J/cm2與5 J/cm2光照對細胞的殺傷效應(yīng)無顯著差異。

表1 人胰腺癌細胞株P(guān)ANC1經(jīng)不同濃度Photosan和不同劑量光照后的A492值

注：與0、1 J/cm2和5 J/cm2比較，aP<0.05，與0、1 J/cm2比較，bP<0.05，cP<0.01；與0 J/cm2比較，dP<0.01

二、PDT對PANC1細胞凋亡的影響

光照劑量為10 J/cm2時，0、2、4 mg/L Photosan濃度時的細胞凋亡率分別為(13.8±1.8)%、(40.9±1.6)%、(62.5±2.0)%，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖1)。

a.0 mg/L Photosan；b.2 mg/L Photosan；c.4 mg/L Photosan

光動力治療(PDT)是腫瘤治療領(lǐng)域中的一項創(chuàng)傷小、對腫瘤特異性高的新技術(shù)。PDT的基礎(chǔ)是光化學(xué)或光生物學(xué)反應(yīng)[3]。其原理是利用光敏劑能在腫瘤組織中選擇性積聚、潴留的特性，經(jīng)特定波長的光照，并在氧分子的參與下，使腫瘤組織內(nèi)的三態(tài)氧變?yōu)榇罅坑卸镜膯螒B(tài)氧、羥基團和過氧化基團等，造成細胞中線粒體、溶酶體及核膜、細胞膜的腫脹、破壞，同時產(chǎn)生血栓素，使腫瘤血管栓塞，致腫瘤細胞死亡[4]。

目前有關(guān)PDT殺傷腫瘤細胞的研究多集中在體表皮膚腫瘤和腔道腫瘤，如食管癌、支氣管肺癌、膀胱癌等，對實體臟器腫瘤方面的報道甚少。隨著激光醫(yī)學(xué)、光敏劑和內(nèi)鏡技術(shù)的發(fā)展，臨床PDT治療胰腺癌將越來越成為可能。本實驗選取目前臨床上最常用的血卟啉衍生物光敏劑——Photosan，觀察不同濃度光敏劑和光照劑量對人胰腺癌細胞株P(guān)ANC1的殺傷效應(yīng)。結(jié)果顯示，單純給予Photosan或單純光照，均無PDT效應(yīng)，說明光敏劑和特定波長的光照都是光動力殺傷腫瘤細胞作用中缺一不可的重要因素，這符合光動力治療的基本特點[5]。同時也提示，光敏劑或相應(yīng)波長的激光，并不具備獨立的生物學(xué)效應(yīng)，正常組織單獨接觸時是安全的。

實驗結(jié)果還顯示，當(dāng)Photosan>1 mg/L、光照劑量>1 J/cm2時才表現(xiàn)出PDT對PANC1細胞的殺傷作用，且隨著光敏劑濃度和光照劑量的增加，其殺傷作用亦相應(yīng)增強，原因可能與細胞對光敏劑的吸收、代謝與排泄的特性以及一定強度的光能量才足以激發(fā)光化學(xué)反應(yīng)有關(guān)。與陳曉華等[6]對食管癌細胞的PDT研究結(jié)果類似。不過，本實驗的光照劑量達到5 J/cm2以上后，PDT效應(yīng)卻無顯著增加，這可能與細胞存在光照飽和有關(guān)。因該劑量的激光已引發(fā)光敏劑產(chǎn)生幾乎最大程度的光化學(xué)反應(yīng)。

PDT殺傷細胞有兩種主要方式：凋亡和壞死。有學(xué)者認為，細胞種類、光敏劑的種類及其在亞細胞上的定位、光照劑量是決定此二種方式的主要因素[7]。本實驗用最大有效光照劑量10 J/cm2時，細胞的凋亡率隨光敏劑濃度的增加而相應(yīng)增加，提示添加血卟啉衍生物的PDT對PANC1細胞殺傷效應(yīng)的胞內(nèi)機制可能與其誘導(dǎo)細胞凋亡有關(guān)。

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[3] 鄭積華,王曉懷,張為民,等. 光敏劑Photofrin Ⅱ預(yù)激活聯(lián)合化療藥物對K562細胞殺傷作用的研究. 中國腫瘤臨床, 2005,32:493-496.

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[6] 陳曉華, 羅榮城,李黎波,等. 人食管癌細胞體外光動力效應(yīng)主要影響因素的實驗研究. 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2007,27:1817-1820.

[7] Juzeniene A,Moan J.The history of PDT in Norway.Part one.Identification of basic mechanisms of general PDT. Photodiagnosis Photodyn Ther, 2007,4:3-11.

2009-09-14)

(本文編輯：屠振興)

Hematoporphyrinderivativephotodynamictherapyofhumanpancreaticcancercellsinvitro

YUZhong,HUANGKai-hong,WANGLing-yun,ZHUZhao-hua,CHENRu-fu,ZHANGJin-xin.

DepartmentofGastroenterology,SecondAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China

ZHUZhao-hua,Email:zhuzhaoh@mail.sysu.edu.cn

ObjectiveTo investigate the killing effect of hematoporphyrin derivative photodynamic therapy (PDT) on cultured human pancreatic cancer cell, and to explore the mechanism of this effect.MethodsBiolitec PDT 630 semi-conductor laser therapeutic apparatus was used as the light source. After pancreatic cancer cell PANC1 was incubated 8 h with different concentrations of Photosan (hematoporphyrin derivative) as photosensitizer (0.5mg/L, 1 mg/L, 2 mg/L, 4 mg/L), the cells were given different doses of 630nm laser irradiation (1 J/cm2,5 J/cm2,10 J/cm2). TheA492value was determined in each group with MTT method. Cell apoptosis rate was detected by flow cytometry after PDT.ResultsThere was no killing effect when no Photosan was administrated; 10 J/cm2irradiation had killing effect on PANC1 when Photosan was administrated as 1 mg/L(0.140±0.013vs0.213±0.008,P<0.05) ; 5 and 10 J/cm2irradiation all had killing effect on PANC1 when Photosan was administrated as 2 mg/L (0.081±0.024 and 0.049±0.013vs0.211±0.031,P<0.05 andP<0.01); all doses of irradiation had killing effect when Photosan was administrated as 4 mg/L. There was no significant difference between 5 and 10 J/cm2irradiation in term of killing effect. Cell apoptosis rates with 0 or 2 or 4 mg/L Photosan and 10 J/cm2irradiation were (13.8±1.8)%,(40.9±1.6)%, (62.5±2.0)%, the difference was statistically significant (P<0.05).ConclusionsPhotosensitizer or irradiation alone did not produce PDT effect. With certain dose of photosensitizer and irradiation, the PDT effect increased accordingly.

Pancreatic neoplasms; Photodynamic Therapy; Hematoporphyrin derivative; Cell line

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.01.011

廣東省自然科學(xué)基金(06021369) 廣東省醫(yī)學(xué)科研基金(B2006043)

510120 廣州，中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科(于鐘、黃開紅、王凌云、朱兆華)，外科(陳汝福)；中山大學(xué)醫(yī)學(xué)統(tǒng)計與流行病學(xué)系(張晉昕)

朱兆華，Email:zhuzhaoh@mail.sysu.edu.cn