LOXL-2在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及與預(yù)后的COX回歸分析*

賴國威， 鄭銳年， 廖玉婷， 趙繼紅

東莞市人民醫(yī)院 1普外科， 2腫瘤內(nèi)科， 3病理科(廣東東莞 523059)

結(jié)直腸癌是嚴(yán)重危害人類健康的消化道惡性腫瘤。根據(jù)2012年GLOBOCAN公布數(shù)據(jù)顯示，全球范圍內(nèi)，每年結(jié)直腸癌新發(fā)病例數(shù)為136萬，死亡病例數(shù)為69萬[1]。近年來，隨著社會經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，居民生活方式和飲食結(jié)構(gòu)西方化，我國結(jié)直腸癌發(fā)病率持續(xù)上升[2]。鑒于目前我國腸癌早期篩查尚未普及，相當(dāng)一部分患者就診時(shí)已屬中晚期。盡管外科手術(shù)和放化療方案不斷優(yōu)化，但晚期結(jié)直腸癌的生存率改善不明顯。結(jié)直腸癌患者治療失敗的主要原因是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，因此，探索腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的新機(jī)制相當(dāng)重要，從而，鑒定新的預(yù)后生物標(biāo)記物可以為結(jié)直腸癌的靶向治療提供新的方向。賴氨酰氧化酶樣蛋白-2(lysyl oxidase like-2 protein, LOXL-2)屬于賴氨酰氧化酶家族成員。既往對賴氨酰氧化酶的研究主要集中在催化細(xì)胞外基質(zhì)、膠原、彈力蛋白等方面[3-4]。新近研究表明，LOXL-2在參與調(diào)控新生血管形成、細(xì)胞分化、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移等過程中亦起重要作用[5-6]。此外，LOXL-2的高表達(dá)與生存期縮短等預(yù)后差有關(guān)。這些數(shù)據(jù)引起了許多研究者的興趣，他們已經(jīng)確定LOXL-2是開發(fā)用于有效腫瘤治療抑制劑的強(qiáng)有力的候選目標(biāo)。但關(guān)于LOXL-2在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，以及其與預(yù)后的相關(guān)性仍需要進(jìn)一步確認(rèn)。本研究旨在探討LOXL-2在結(jié)直腸癌中與臨床病理參數(shù)及與預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2005年1月至2010年12月東莞市人民醫(yī)院胃腸外科結(jié)直腸癌手術(shù)患者的癌組織標(biāo)本及癌旁正常結(jié)直腸黏膜標(biāo)本85例，其中伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織35例。所有納入患者術(shù)前未接受放化療，術(shù)后經(jīng)病理診斷證實(shí)。依據(jù)AJCC第7版TNM分期對患者進(jìn)行病理分期。本研究得到東莞市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，研究對象均已簽署知情同意書。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分別使用RNAiso Plus和RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit提取組織總RNA和合成cDNA。建立25 μL的PCR反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。LOXL-2上、下游引物序列分別為5′-CACCCACTATGACCTGCTGA-3′和5′-TCTTCTGGATGTCTCCTTCACA-3′；GAPDH上、下游引物序列分別為5′-TGAACGGAAGCTCACTG-3′和5′-GCTTCACCACCTTCTTGATG-3′。

1.3 免疫組化染色 采用EnVision法檢測標(biāo)本中LOXL-2的表達(dá)情況。一抗購自美國Abcam公司的山羊抗人LOXL-2多克隆抗體(1∶500稀釋)。采用Dako公司EnVisionTM+System試劑盒進(jìn)行二抗標(biāo)記和顯色。采用文獻(xiàn)報(bào)道的常用的評分方法，陽性細(xì)胞比例分為：無=0;<10%=1; 10%～50%=2; 51%～80%=3;>80%=4，染色強(qiáng)弱分為：無=0; 弱=1; 中=2; 強(qiáng)=3，根據(jù)兩者的乘積進(jìn)行免疫反應(yīng)評分，按照評分分值，判斷為陰性(0～3)、低表達(dá)(4～6)、中表達(dá)(7～9)和高表達(dá)(10～12)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用Chi-square檢驗(yàn)分析計(jì)數(shù)資料組間差異及LOXL-2表達(dá)與臨床病理參數(shù)關(guān)系。采用t檢驗(yàn)分析qPCR結(jié)果。LOXL-2的表達(dá)及與預(yù)后行Cox回歸分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LOXL-2 mRNA在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況 qPCR結(jié)果顯示，在結(jié)直腸癌組織和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中LOXL-2 mRNA的表達(dá)量分別為0.782±0.091和0.871±0.086，而在鄰近正常腸黏膜組織中LOXL-2 mRNA的表達(dá)量為0.215±0.073。LOXL-2 mRNA在結(jié)直腸癌組織和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中的表達(dá)量高于鄰近正常腸黏膜組織(P<0.05)。

2.2 LOXL-2蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況 免疫組化染色結(jié)果顯示，LOXL-2 在正常腸黏膜組織、結(jié)直腸癌組織和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中均有表達(dá)，且表達(dá)強(qiáng)度呈遞增趨勢(表1)。其中LOXL-2 在結(jié)直腸癌組織和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中的表達(dá)與鄰近正常腸黏膜組織相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)直腸癌腫瘤組織中的LOXL-2的表達(dá)陰性和陽性代表圖見圖1。

表1 LOXL-2在正常腸黏膜組織、結(jié)直腸癌組織和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中的表達(dá) 例

*與正常腸黏膜組織比較P<0.05

2.3 LOXL-2蛋白的表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 在入選的結(jié)直腸癌中，LOXL-2蛋白表達(dá)水平與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期相關(guān)(P<0.05)，而與患者的性別、年齡、組織學(xué)類型等參數(shù)無明顯的相關(guān)性(P>0.05)，見表2。

2.4 LOXL-2的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系 LOXL-2高表達(dá)的患者其3年和5年總體生存率(OS)分別為77.6%和55.9%，LOXL-2低表達(dá)患者3年和5年OS分別為88.7%和66.6%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.037)，見圖2。

2.5 LOXL-2的表達(dá)與預(yù)后的Cox回歸分析 單因素分析結(jié)果顯示，高水平表達(dá)的LOXL-2與結(jié)直腸癌患者的OS顯著相關(guān)(HR=4.312,95%CI：1.598～8.220，P=0.006)，同時(shí)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)與OS顯著相關(guān)(P<0.05)；多因素分析結(jié)果顯示，LOXL-2和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)是OS(HR=3.368，P=0.007;HR=2.457，P=0.013)的獨(dú)立預(yù)后因素，見表3。

A：LOXL-2表達(dá)陰性；B：LOXL-2表達(dá)陽性

3 討論

結(jié)直腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一。根據(jù)2017年國家癌癥中心發(fā)布的數(shù)據(jù)，城市地區(qū)結(jié)直腸癌在男性腫瘤發(fā)病率中居第5位，在女性中居第3位。盡管臨床治療方式不斷進(jìn)步，但是，中晚期結(jié)直腸癌的死亡率仍然改善不明顯。主要原因是腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移導(dǎo)致結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)和死亡。結(jié)直腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個(gè)多因素、多階段、多步驟的復(fù)雜過程，涉及細(xì)胞外基質(zhì)的溶解、細(xì)胞黏附性降低和細(xì)胞游走等多個(gè)環(huán)節(jié)及眾多基因的異常表達(dá)調(diào)控[7-10]。

賴氨酰氧化酶(lysyl oxidase LOX)家族由5個(gè)成員組成，一些成員最近成為腫瘤進(jìn)展的重要調(diào)控因子。其中LOXL-2是目前最典型的LOX，也是研究最全面的成員。LOXL-2是一種分泌型銅依賴性氨基酸氧化酶，主要通過催化賴氨酸殘基的肽基氧化脫氨，促進(jìn)共價(jià)蛋白的交聯(lián)，參與細(xì)胞黏附、遷移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等病理生理過程。隨著研究的深入，學(xué)者們越來越多關(guān)注LOXL-2在參與調(diào)控腫瘤血管生成、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移等過程中的作用[11-12]。Kirschmann等[13]研究發(fā)現(xiàn)LOXL-2在高侵襲性的乳腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)明顯高于低侵襲性的乳腺癌細(xì)胞株，提示LOXL-2在乳腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。Peng等[14]研究發(fā)現(xiàn)，LOXL-2能夠誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)，應(yīng)用LOXL-2特異性抗體作用后胃癌的生長和轉(zhuǎn)移受到顯著抑制。在胰腺癌中，LOXL-2表達(dá)明顯上調(diào)并參與了胰腺癌抵抗吉西他濱的過程[15]。近年研究發(fā)現(xiàn)，LOXL-2主要通過激活Snail/Ecadherin通路或Src/FAK通路參與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[16-17]。LOXL-2通過下調(diào)Snail，抑制鈣黏蛋白E(E-cadherin)的表達(dá)，E-cadherin是上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的標(biāo)志性蛋白，EMT被認(rèn)為是腫瘤演進(jìn)的重要過程。此外，LOXL-2在胃癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中與腫瘤分化以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可作為預(yù)后預(yù)測的新型標(biāo)志物[18]。LOXL-2首次被描述為喉部鱗狀細(xì)胞癌的預(yù)后標(biāo)志物[19-22]。Peinado等[23]通過免疫組織化學(xué)方法研究了LOXL-2在256例人喉鱗狀細(xì)胞癌中蛋白表達(dá)情況,并發(fā)現(xiàn)了LOXL-2表達(dá)增加與局部復(fù)發(fā)增加相關(guān)，此外，高表達(dá)LOXL-2與喉鱗狀細(xì)胞癌、肺鱗狀細(xì)胞癌和淋巴結(jié)陰性乳腺癌患者的總生存期和無病生存縮短有關(guān)。隨后的多項(xiàng)研究表明，LOXL-2高表達(dá)或過表達(dá)與胃癌[21]、結(jié)腸癌[22，24]、基底樣乳腺癌[25]、胰腺癌[20]和肝細(xì)胞癌[21]的預(yù)后差、生存率降低有關(guān)。

表2 85例結(jié)直腸癌組織中LOXL-2的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 例

LOXL-2表達(dá)與OS的生存分析，與LOXL-2低表達(dá)組相比，LOXL-2高表達(dá)組的OS更差(P<0.01)

圖2 LOXL-2表達(dá)對結(jié)直腸癌患者預(yù)后的影響

表3 LOXL-2的表達(dá)與OS的Cox回歸分析

在本研究中，我們通過熒光定量PCR和免疫組化染色技術(shù)對85例結(jié)直腸癌臨床樣本進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，LOXL-2在結(jié)直腸癌組織和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中的表達(dá)水平顯著高于正常腸黏膜組織(P<0.01)，而且LOXL-2與結(jié)直腸癌患者的臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等參數(shù)相關(guān)，提示LOXL-2可能在結(jié)直腸癌的侵襲、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮作用。最后本研究通過Cox回歸分析探討了LOXL-2對結(jié)直腸癌患者預(yù)后的影響，經(jīng)過調(diào)整各項(xiàng)協(xié)變量后，得到了結(jié)直腸癌組織中LOXL-2高表達(dá)明確為結(jié)直腸癌患者預(yù)后差的風(fēng)險(xiǎn)因素。上述研究結(jié)果提示LOXL-2的異常表達(dá)在結(jié)直腸癌的惡性演進(jìn)過程中可能起重要作用，有可能作為預(yù)防和治療結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的新靶點(diǎn)。

綜上所述，LOXL-2的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分期密切相關(guān)，結(jié)直腸癌組織中LOXL-2高表達(dá)為結(jié)直腸癌患者預(yù)后差的風(fēng)險(xiǎn)因素。