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    黃連類寒熱藥對(duì)體外抗流感病毒的影響

    2021-03-25 11:16:40俞程玲吳巧鳳
    中成藥 2021年3期
    關(guān)鍵詞:紫蘇葉干姜吳茱萸

    俞程玲,吳巧鳳

    (浙江中醫(yī)藥大學(xué),浙江 杭州 310053)

    流感是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病,其發(fā)病率、死亡率及造成的經(jīng)濟(jì)損失均位列各種傳染病之首[1]。中醫(yī)藥防治流感歷史悠久,優(yōu)勢(shì)獨(dú)特,具有辨證施治,不易耐藥等特點(diǎn),中藥可通過多成分、多途徑、多靶點(diǎn)、多效應(yīng)地發(fā)揮抗流感藥效[2]。流感在中醫(yī)屬溫病范疇,并倡導(dǎo)“寒熱并用” 的治則[3]。黃連為典型的苦寒中藥,黃連及其主要活性成分鹽酸小檗堿均具有顯著的抗流感病毒作用[4-5],黃連也常以寒熱配伍的方式出現(xiàn)在黃連香薷飲,半夏瀉心湯和蘇葉黃連湯等諸多方劑中[6-8],黃連亦可與諸多熱性和溫性中藥(如干姜、厚樸等) 配伍形成寒熱藥對(duì),并作為最小的復(fù)方發(fā)揮療效[9-12]。項(xiàng)目組前期發(fā)現(xiàn),黃連類寒熱藥對(duì)黃連-干姜,黃連-紫蘇葉和黃連-厚樸[6]均具有抗流感病毒作用,且藥對(duì)的抗流感藥效優(yōu)于單味藥。但黃連類寒熱藥對(duì)抗流感作用的系統(tǒng)研究未見報(bào)道。本文通過查閱含黃連類寒熱藥對(duì)的古方,采用Apriori 關(guān)聯(lián)規(guī)則分析法篩選與黃連關(guān)聯(lián)度較高的熱,溫性中藥,配伍成寒熱藥對(duì),進(jìn)一步采用細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE) 與MTT 法,以流感病毒抑制率為評(píng)價(jià)指標(biāo),考察黃連類寒熱藥對(duì)的體外抗流感病毒作用強(qiáng)弱,篩選抗流感病毒作用最強(qiáng)的藥對(duì),為含黃連類寒熱藥對(duì)的復(fù)方的臨床應(yīng)用及流感治療提供參考。

    1 材料

    1.1 藥物與試劑 黃連(四川,批號(hào)20170501) 為毛茛科植物黃連Coptis chinensisFranch.的干燥根莖,半夏(浙江,批號(hào)20180701) 為天南星科植物半夏Pinellia ternata(Thunb.) Breit.,厚樸(浙江,批號(hào)20180701) 為木蘭科植物厚樸Magnolia officinalisRend.Et Wils.的干燥干皮、根皮和枝皮,附子(四川,批號(hào)20180301) 為毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaeliiDebx.的子根的加工品,肉桂(廣西,批號(hào)20180601) 為樟科植物肉桂Cinnamomum cassiaPresl 的干燥樹皮,吳茱萸(浙江,批號(hào)20180701) 為蕓香科植物吳茱萸Euodia rutaecarpa(Juss.) Benth.的干燥近成熟果實(shí),紫蘇葉(浙江,批號(hào)20171001) 為唇形科植物紫蘇Perilla frutescens(L.) Britt.的干燥葉(或帶嫩枝),干姜(四川,批號(hào)20171101) 為姜科植物姜Zingiber officinaleRosc.的干燥根莖,所有藥材均購(gòu)自浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠,經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與鑒定教研室張水利教授鑒定為正品。磷酸奧司他韋膠囊(瑞士羅氏有限公司,批號(hào)M1025);MEM 培養(yǎng)液(批號(hào)1898620)、胎牛血清(批號(hào)1808455)、谷氨酰胺(批號(hào)1677185)、0.25% EDTA-胰酶(批號(hào)1846496)、PBS (批號(hào)1864553)、青/鏈霉素母液(批號(hào)92SLBB76) 均購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司。

    1.2 儀器 705 型-80 ℃超低溫冰箱(美國(guó)Thermo 公司);A2 型生物安全柜(美國(guó)Thermo 公司);3111 型CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo 公司);R-4100 型酶標(biāo)儀(美國(guó)Dynatech 公司);DC-300 型倒置顯微鏡(德國(guó)Leica 公司)。

    1.3 病毒和細(xì)胞株 甲型流感病毒A/PR/8/34 鼠適應(yīng)株(H1N1) 及MDCK 細(xì)胞株均由浙江省疾病預(yù)防控制中心病毒所提供,于-80 ℃冰箱超低溫保存。流感病毒株經(jīng)雞胚傳代后,經(jīng)測(cè)定血凝效價(jià)為1 ∶1 024。

    2 方法

    2.1 黃連類寒熱藥對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)建立 從中國(guó)方劑數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索出含有黃連類寒熱藥的方劑共193 首,排除標(biāo)準(zhǔn)為單味藥方劑、組成重復(fù)的方劑、未含黃連類寒熱藥對(duì)的方劑,數(shù)據(jù)錄入Microsoft Excel 2010 軟件中。為確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性,必須進(jìn)行雙人核對(duì)。

    2.2 數(shù)據(jù)分析 采用Excel 2010、SPSS Modeler 18.0 軟件,對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行Apriori 關(guān)聯(lián)規(guī)則分析。

    2.3 藥液的制備 檢索文獻(xiàn)中各藥對(duì)的臨床常用配比發(fā)現(xiàn),黃連-半夏藥對(duì)為1 ∶1 和1 ∶3[13],黃連-紫蘇葉藥對(duì)為1 ∶1、2 ∶1、3 ∶1 和4 ∶1[14],黃連-干姜藥對(duì)為1 ∶1和1 ∶3[13],黃連-附子藥對(duì)為2 ∶1、3 ∶2、2 ∶3、1 ∶1 和4 ∶1[15],黃連-肉桂藥對(duì)為10 ∶1、4 ∶1和2 ∶1[16],黃連-吳茱萸為1 ∶1、2 ∶1 和6 ∶1[17],黃連-厚樸藥對(duì)為1 ∶1、1 ∶2、2 ∶1 和2 ∶3[18]。結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù),經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)及前期研究結(jié)果,確定黃連-厚樸[19]、黃連-半夏、黃連-紫蘇葉、黃連-干姜、黃連-附子、黃連-肉桂和黃連-吳茱萸各藥對(duì)配比分別為1 ∶1、1 ∶3、1 ∶1、1 ∶1、2 ∶1、10 ∶1 和6 ∶1時(shí)體外抗流感作用最強(qiáng)。取上述配比的藥對(duì)及單味藥(黃連、半夏、紫蘇葉、干姜、附子、肉桂、吳茱萸和厚樸),各加10 倍量水回流提取2 次,每次1 h,合并提取液,濃縮至相當(dāng)于含生藥量0.4 g/mL,即得相應(yīng)提取藥液,4 ℃冷藏。臨用時(shí),用PBS 稀釋至所需濃度。

    2.4 藥物對(duì)MDCK 細(xì)胞毒性的測(cè)定 將黃連類寒熱藥對(duì)及各單味藥提取液倍比稀釋成9 個(gè)質(zhì)量濃度(25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.781、0.391、0.195、0.098 mg/mL),分別加至96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板(濃度約1.5×105/mL,下同)中,每孔100 μL,平行設(shè)4 個(gè)復(fù)孔,同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照組,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),于倒置顯微鏡下逐日觀察各組的細(xì)胞形態(tài),48 h 后終止培養(yǎng),觀察各組的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。

    2.5 流感病毒半數(shù)細(xì)胞感染量(TCID50) 的測(cè)定 取貼壁且長(zhǎng)成單層的96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板,PBS 輕洗2~3 次。取流感病毒原液用細(xì)胞維持液以10 倍比梯度稀釋,稀釋液濃度為10-1~10-8。取不同濃度的病毒稀釋液,以每孔100 μL 依次接種于細(xì)胞(每個(gè)濃度稀釋液平行設(shè)置8 個(gè)復(fù)孔),設(shè)置正常對(duì)照組(只加細(xì)胞維持液,不加流感病毒)。將接毒后的培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待流感病毒感染細(xì)胞1 h 后棄病毒液,PBS 輕洗2~3 次,加入細(xì)胞維持液(每孔100 μL),常規(guī)培養(yǎng)72 h[20-21],并于倒置顯微鏡下逐天觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE),記錄各孔細(xì)胞病變狀況及孔數(shù)。采用Reed-Muench 法,計(jì)算流感病毒半數(shù)細(xì)胞感染量(TCID50)。

    2.6 藥物對(duì)流感病毒感染MDCK 細(xì)胞活性的影響 取細(xì)胞維持液將黃連類寒熱藥對(duì)及各單味藥提取液倍比稀釋成3 個(gè)濃度梯度,與50TCID50的流感病毒液等體積混合,將藥液與病毒混合液接種于MDCK 細(xì)胞培養(yǎng)板中,100 μL/孔,各濃度設(shè)3 個(gè)平行復(fù)孔,設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組(每孔加100 μL 0.01 mg/mL 奧司他韋稀釋液)、病毒對(duì)照組(每孔加100 μL的病毒生長(zhǎng)液) 和正常對(duì)照組(只加細(xì)胞維持液),置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,每孔加20 μL 的MTT試劑,培養(yǎng)4 h 后加入150 μL/孔的DMSO,振蕩10 min,酶標(biāo)儀于490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD490,并計(jì)算藥物對(duì)病毒的抑制率,公式如下。

    2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行處理,結(jié)果以() 表示,各組數(shù)據(jù)先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差分析,若符合正態(tài)分布和方差齊性,則采用ANOVA 分析;若方差不齊性,則進(jìn)行非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    3 結(jié)果

    3.1 Apriori 關(guān)聯(lián)規(guī)則分析 使用SPSS Modeler 18.0 軟件對(duì)193 首含黃連類寒熱藥對(duì)的方劑中黃連與熱、溫性中藥進(jìn)行關(guān)聯(lián)規(guī)則挖掘,構(gòu)建“數(shù)據(jù)源→類型→Apriori→網(wǎng)絡(luò)”的關(guān)聯(lián)規(guī)則數(shù)據(jù)流,并設(shè)置條件(支持度≥15.0%,置信度≥90%,前項(xiàng)數(shù)≤2),得到藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則7 條。由表1、圖1 可見,與黃連高頻配伍的熱、溫性中藥分別是半夏、厚樸、附子、肉桂、吳茱萸、紫蘇葉和干姜,故確定黃連-半夏、黃連-厚樸、黃連-附子、黃連-肉桂、黃連-吳茱萸、黃連-紫蘇葉、黃連-干姜作為研究對(duì)象。

    表1 黃連類寒熱藥對(duì)的關(guān)聯(lián)規(guī)則分析

    圖1 黃連類寒熱藥對(duì)的關(guān)聯(lián)規(guī)則網(wǎng)狀圖

    3.2 藥物對(duì)MDCK 細(xì)胞的毒性測(cè)定結(jié)果 由表2 可知,黃連、肉桂、吳茱萸、半夏、附子、紫蘇葉、干姜、厚樸最大無(wú)毒質(zhì)量濃度分別為0.391、0.39、0.39、1.56、3.125、6.25、6.25、12.5 mg/mL。由表3 可知,黃連-半夏,黃連-厚樸,黃連-附子,黃連-肉桂,黃連-吳茱萸,黃連-紫蘇葉、黃連-干姜最大無(wú)毒質(zhì)量濃度分別為1.56、6.25、1.56、0.195、0.195、0.781、1.56 mg/mL,對(duì)細(xì)胞的毒性依次為黃連-吳茱萸=黃連-肉桂>黃連-紫蘇葉>黃連-半夏=黃連-附子=黃連-干姜>黃連-厚樸,即黃連-厚樸藥對(duì)的細(xì)胞毒性最小。

    表2 單味藥的最大無(wú)毒濃度(n=4)

    表3 黃連類寒熱藥對(duì)的最大無(wú)毒濃度(n=4)

    3.3 細(xì)胞半數(shù)感染量(TCID50) 的測(cè)定結(jié)果 根據(jù)病毒感染MDCK 細(xì)胞引起的細(xì)胞病變情況,采用Reed-Muench 法測(cè)得細(xì)胞半數(shù)感染量TCID50為1.0×10-4.1/0.1 mL。

    3.4 對(duì)流感病毒感染的MDCK 細(xì)胞活性的影響 由表4 可知,在細(xì)胞最大無(wú)毒質(zhì)量濃度范圍內(nèi),7 個(gè)藥對(duì)對(duì)流感病毒的抑制率均隨其質(zhì)量濃度的增大而遞增,即抗病毒活性逐漸加強(qiáng),呈現(xiàn)顯著的量效關(guān)系。在最大無(wú)毒質(zhì)量濃度時(shí),黃連-半夏、黃連-厚樸、黃連-附子、黃連-肉桂、黃連-吳茱萸、黃連-紫蘇葉、黃連-干姜對(duì)流感病毒的抑制率分別為 39.33%、69.18%、43.57%、52.19%、60.00%、67.54%、61.23%,與病毒對(duì)照組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。黃連、厚樸、干姜、紫蘇葉、肉桂、附子、吳茱萸、半夏單味藥在最大無(wú)毒質(zhì)量濃度時(shí)對(duì)流感病毒的抑 制率分別 為 37.67%、33.95%、49.05%、61.72%、32.57%、40.62%、44.71%、34.76%,與病毒對(duì)照組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。綜上所述,各藥對(duì)的抗流感病毒作用均優(yōu)于配伍的兩單味藥。

    4 討論

    關(guān)聯(lián)規(guī)則挖掘可從數(shù)據(jù)背后發(fā)現(xiàn)事物之間可能存在的關(guān)聯(lián),適用于在大量方劑中挖掘潛在的藥物組合,其中Apriori 算法是關(guān)聯(lián)規(guī)則中最經(jīng)典和最有影響力的算法,其余算法(DHP 算法,Partition 算法和Samping 算法等) 大多以Apriori 算法為核心,是Apriori 算法的變體或擴(kuò)展[22-23]。本文采用關(guān)聯(lián)規(guī)則挖掘,結(jié)合Apriori 算法對(duì)含黃連類寒熱藥對(duì)古方中黃連和熱,溫性中藥進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析,挖掘隱含的用藥規(guī)律,結(jié)果顯示,半夏,厚樸,附子,肉桂,吳茱萸,紫蘇葉和干姜等7 味中藥與黃連關(guān)聯(lián)度較高,且黃連-半夏、黃連-厚樸、黃連-附子、黃連-肉桂、黃連-吳茱萸和黃連-紫蘇葉均為經(jīng)典的黃連類寒熱藥對(duì)[22-25],與Apriori 關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果一致。據(jù)報(bào)道,厚樸丸、黃連香薷飲和連樸飲等經(jīng)典方均包含黃連-厚樸藥對(duì),厚樸丸和連樸飲臨床常用于治療脾胃疾病,而黃連香薷飲(僅有黃連、厚樸和香薷組成) 用于治療暑濕感冒、時(shí)疫感冒等癥狀,項(xiàng)目組首次發(fā)現(xiàn)其具有抗H1N1 流感病毒作用,且拆方研究顯示,黃連-厚樸藥對(duì)的抗流感藥效優(yōu)于全方及各單味藥[6]。6 個(gè)經(jīng)典方如半夏瀉心湯(含黃連-半夏)、附子湯(含黃連-附子)、交泰丸(含黃連-肉桂)、左金丸(含黃連-吳茱萸)、蘇葉黃連湯(含黃連-紫蘇葉) 和烏梅丸(含黃連-干姜) 常用于脾胃疾病的治療,其中半夏瀉心湯和附子湯也可用于治療外感?。?6-29],但6 個(gè)方劑(包括各所含的黃連類寒熱藥對(duì)) 的抗流感作用研究未見報(bào)道。本文研究顯示7 個(gè)黃連類寒熱藥對(duì)均有體外抗流感病毒作用,且黃連-厚樸藥對(duì)的抗流感病毒作用最強(qiáng)。

    表4 黃連類寒熱藥對(duì)對(duì)流感病毒感染MDCK 細(xì)胞活性的影響(, n=3)

    表4 黃連類寒熱藥對(duì)對(duì)流感病毒感染MDCK 細(xì)胞活性的影響(, n=3)

    注:與病毒對(duì)照組比較,**P<0.01。

    藥對(duì)的配伍比例不同,將導(dǎo)致藥效的差異。本文根據(jù)7 個(gè)藥對(duì)的文獻(xiàn)常用配比[13-19],并結(jié)合抗流感預(yù)實(shí)驗(yàn),確定各藥對(duì)抗流感作用的最佳配比(黃連-半夏、黃連-紫蘇葉、黃連-干姜、黃連-附子、黃連-肉桂和黃連-吳茱萸的配比分別為1 ∶3、1 ∶1、1 ∶1、2 ∶1、10 ∶1、6 ∶1),這些配比均為臨床常用經(jīng)方中的經(jīng)典配比之一,體現(xiàn)了經(jīng)典方劑中藥對(duì)配比的科學(xué)性。根據(jù)此配比進(jìn)一步考察各藥對(duì)的抗流感作用強(qiáng)弱,較為科學(xué)。

    本實(shí)驗(yàn)采用MTT 法比較了7 個(gè)黃連類寒熱藥對(duì)體外抗流感病毒作用的強(qiáng)弱,確定黃連-厚樸為抗流感藥效最佳的黃連類寒熱藥對(duì),為下一步繼續(xù)開展體內(nèi)抗流感作用研究奠定了基礎(chǔ),也可為含黃連類寒熱藥對(duì)復(fù)方的臨床應(yīng)用及流感治療提供參考。

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