新城疫病毒RT-PCR 一步法的建立及應用

耿 崗

（青海省海西州烏蘭縣畜牧獸醫(yī)工作站，青海烏蘭817100）

新城疫病毒屬于副黏病毒科（Paramyxoviridae）副黏病毒亞科（Paramyxovirinae）中的禽腮腺炎病毒屬（Avulavirus），是一種不分節(jié)段的單鏈、負鏈RNA病毒［1-2］。由NDV引起的新城疫（Newcastle disease，ND）是一種多病型的高度接觸性、急性、烈性傳染病，可感染火雞、家禽以及野禽類，具有傳播速度快、發(fā)病率高、病死率高等特征，已經(jīng)在世界范圍內(nèi)引起了4次大流行，給全球養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失［3-8］。該病也是困擾我國養(yǎng)禽業(yè)的重要疫病，幾十年來一直是我國養(yǎng)禽業(yè)堅持預防免疫控制的主要傳染病之一［9-11］。該病的存在嚴重制約著我國養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展，同時對我國禽類產(chǎn)品的出口、食品安全以及人類健康都存在著潛在的危害［11］。因此，加強NDV診斷技術的研究，對預防和控制本病以及人類健康都具有十分重要的現(xiàn)實意義。NDV常規(guī)的病毒分離技術和免疫血清學檢測方法存在操作復雜、費時費力、檢測周期較長等缺點，不能滿足快速、準確診斷的需要。鑒于此，本研究建立了一種敏感、特異、準確、簡單、快速的一步法RT-PCR方法，為ND的早期診斷、流行病學調(diào)查等提供一種有效的檢測技術手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 新城疫病毒（NDV）、傳染性支氣管炎病毒（IBV）、傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）、傳染性法氏囊病病毒（IBDV）均由青海省動物疾病中心實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、Trizol為上海生工生物工程技術服務有限公司產(chǎn)品；一步法RT-PCR試劑盒為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 根據(jù)已發(fā)表的NDV基因組序列，利用生物學軟件設計合成一對引物，NDVP1：5′-GGCCGCAGCTCTGATACAA-3′； NDVP2：5′-TACATACAGGCCGACGTATT-3′，將 引物序列送上海生工生物工程技術服務有限公司合成。1.2.2 病毒的增殖 將NDV經(jīng)尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，收集120h雞胚尿囊液，于4℃以10 000 r／min離心15min，取上清，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 病毒基因組RNA的提取 取上述的NDV病毒液200μL，加Trizol試劑600μL，按照Trizol試劑的使用說明提取NDV基因組RNA，紫外分光光度計測定含量。

1.2.4 RT-PCR擴增反應 根據(jù)一步法RT-PCR檢測試劑盒說明書確定RT-PCR反應體系為：25 μL 2×1step buffer，2μL Prime Script 1step enzyme mix，上 下 游 引 物 NDVP1、NDVP2 （20 μmol／μL）適量，模板 RNA 適量，加水至50μL。RT-PCR反應條件為：50℃45min；94℃3min；94℃45s，適宜溫度45s，72℃45s，30個循環(huán)；72℃10min，4℃終止反應。

1.2.5 RT-PCR擴增反應優(yōu)化

1.2.5.1 最適模板含量的確定 測定提取的病毒基因組RNA濃度后，適當稀釋，使其分別含RNA 10μg、1μg、0.1μg、10ng、1ng、0.1ng，分別以RNA為模板，保持其他反應條件不變，進行RTPCR擴增，確定最佳模板含量。

1.2.5.2 最適引物含量的確定 在RT-PCR反應體系中分別加入上下游引物（20μmol／L）0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1μL，其他反應條件不變，進行 RTPCR擴增，確定最佳引物含量。

1.2.5.3 最適退火溫度的確定 RT-PCR反應的退火溫度分別設50、52、54、56、58℃，進行 RT-PCR擴增，確定最佳退火溫度。

1.2.6 RT-PCR擴增產(chǎn)物的檢測及鑒定 取擴增產(chǎn)物5μL，在10g／L的瓊脂糖凝膠上電泳，用凝膠成像系統(tǒng)掃描進行初步分析鑒定。然后用膠回收試劑盒回收目的片段，與pMD18-T克隆載體于4℃過夜連接，取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌感受態(tài)細胞DH5α，挑取生長的單菌落過夜培養(yǎng)增菌，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，經(jīng)EcoRⅠ／HindⅢ雙酶切鑒定后得到陽性克隆，送上海生工生物工程技術服務有限公司進行序列測定。

1.2.7 RT-PCR敏感性試驗 提取NDV RNA后定量，然后10倍梯度稀釋提取的病毒基因組RNA，使其分別相當于含有10μg、1μg、0.1μg、10ng、1ng、0.1ng RNA，以稀釋的RNA為模板分別進行RT-PCR擴增，確定該檢測方法的敏感性。

1.2.8 RT-PCR交叉反應試驗 分別提取新城疫病毒（NDV）、傳染性支氣管炎病毒（IBV）、傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）、傳染性法氏囊病病毒（IBDV）的RNA或DNA，用已建立的方法進行擴增，確定建立的檢測方法的特異性。

1.2.9 RT-PCR重復性試驗 用建立的RT-PCR檢測方法，對新城疫病毒（NDV）、傳染性支氣管炎病毒（IBV）、傳染性法氏囊病病毒（IBDV）、傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）、3份NDV陽性樣品、3份NDV陰性樣品重復檢測3次，確定本方法的重復性和穩(wěn)定性。

1.2.10 RT-PCR方法的臨床應用 取現(xiàn)地送檢的雞肝、脾、氣管等組織病料樣品共計68份，用建立的一步法RT-PCR方法進行檢測，對檢測結(jié)果為陽性和陰性的部分樣品進行病毒分離鑒定，比較該RTPCR方法相對于病毒分離鑒定的符合率。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR擴增反應的確定

根據(jù)試驗確定最適模板含量為0.1μg，最適引物含量為10μmol，最適退火溫度為54℃。確定RT-PCR反應體系為：25μL 2×1step buffer，2μL prime script 1step enzyme Mix，上下游引物NDVP1、NDVP2（20μmol／μL）各0.5μL，5μL RNA，加水至50μL。RT-PCR反應條件為：50℃45min；94℃3min；94℃45s，54℃45s，72℃45s，30個循環(huán)；72℃10min，4℃終止反應。

2.2 RT-PCR擴增產(chǎn)物的檢測

RT-PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)10g／L瓊脂糖凝膠電泳，顯示在約705bp處可見一個特異性條帶，與預期的大小相符（圖1）。

2.3 RT-PCR擴增產(chǎn)物的序列鑒定

RT-PCR擴增產(chǎn)物連接到pMD18-T克隆載體上，用EcoRⅠ／HindⅢ進行雙酶切鑒定（圖2）。將雙酶切鑒定正確的克隆送上海生工生物工程技術服務有限公司測序表明，插入到T載體上的基因片段與NDV La Sota株的核苷酸序列一致。

圖1 RT-PCR擴增結(jié)果Fig.1 Result of RT-PCR amplification

圖2 RT-PCR產(chǎn)物的雙酶切鑒定Fig.2 Identification of RT-PCR products by enzyme digestion

2.4 敏感性試驗結(jié)果

不同模板含量的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)10g／L瓊脂糖凝膠電泳分析（圖3），可以看出RT-PCR檢測的靈敏度可以達到1ng RNA。

2.5 交叉反應試驗結(jié)果

用該一步法RT-PCR方法僅對NDV擴增出了705bp的特異性基因片段，而對IBV、IBDV、ILTV均未擴增出基因片段（圖4）。說明該檢測方法具有較高的特異性。

2.6 重復性試驗結(jié)果

經(jīng)過3次重復檢測，試驗結(jié)果完全一致，說明該一步RT-PCR方法顯示出了較好的穩(wěn)定性和重復性（圖5）。

圖3 敏感性試驗結(jié)果Fig.3 Sensitivity test result

圖4 特異性試驗結(jié)果Fig.4 Specificity test result

圖5 一次重復性試驗結(jié)果Fig.5 One reproducibility test result

2.7 RT-PCR方法的臨床應用結(jié)果

用本研究建立的一步法RT-PCR方法檢測了現(xiàn)地送檢的雞肝、脾、氣管等組織病料樣品共計68份，檢出陽性樣品53份，陽性率77.9%。選取RTPCR檢測的10份陽性樣品和10份陰性樣品，進行病毒的分離鑒定，結(jié)果10份陽性樣品中有9份成功分離到NDV，10份陰性樣品中均沒有分離到NDV。表明該RT-PCR方法相對于病毒分離鑒定的符合率為95%（19／20），具有較好的臨床應用適用性。

3 討論

典型的新城疫根據(jù)臨床癥狀、病理變化、流行病學等資料可做出診斷。但目前新城疫的流行發(fā)生了變化，常常出現(xiàn)非典型新城疫，因非典型新城疫臨床癥狀和病理變化不明顯，呈現(xiàn)出非急性致病性，根據(jù)臨床資料常常難以做出準確診斷，需要采用實驗室方法進行確診［12］。而且目前包括我國在內(nèi)的多數(shù)國家普遍使用新城疫病毒活疫苗，家禽中往往有緩發(fā)型NDV毒株存在，給新城疫的診斷又增加了難度［12］。病毒分離鑒定是新城疫最經(jīng)典、最權威的病原檢測方法，但所需檢測時間較長，且對感染潛伏期尚未出現(xiàn)臨床癥狀的機體檢測不出體內(nèi)的NDV。RT-PCR技術可以檢測樣本中特定病原體的核酸序列，且能夠檢測處于潛伏期的機體中的NDV，具有常規(guī)檢測方法無法比擬的優(yōu)勢，為NDV的早期檢測提供了一種科學的模式和方法。早在2008年，溫貴蘭等［13］就利用RT-PCR方法鑒定分離的新城疫病毒，并應用該方法的3對新城疫特異性鑒定引物對自然發(fā)病雞的腦、脾、咽喉試子、泄殖腔試子等組織病料進行新城疫病毒檢測，其檢測結(jié)果和傳統(tǒng)病毒分離與毒力鑒定的結(jié)果相一致。魏潤生等［14］建立了針對雞傳染性支氣管炎病毒、新城疫病毒和禽流感病毒的多重RT-PCR鑒別診斷方法，可用于NDV與雞傳染性支氣管炎病毒、禽流感病毒的快速鑒別診斷，但操作較復雜。郭浩等［15］用雙抗夾心ELISA法、懸液芯片系統(tǒng)、RT-PCR 3種方法對新城疫病毒進行了檢測，并比較了這3種檢測方法的優(yōu)缺點，得出PR-PCR檢測方法雖然所需試劑、儀器設備較昂貴，但其在核酸水平上對病毒進行檢測，靈敏度較高，具有廣闊的應用前景。本研究在總結(jié)前人研究結(jié)果的基礎上，根據(jù)NDV保守區(qū)序列設計一對特異性引物，建立了檢測NDV的一步RTPCR方法。該RT-PCR方法使用一步法RT-PCR檢測試劑盒，使操作更簡單、檢測更快速、耗時更少，整個檢測過程在3h內(nèi)即可完成?？傊?，本研究建立的NDV一步法RT-PCR方法敏感、特異、準確、簡單、快速，適用于ND的早期快速診斷，將為ND的臨床診斷及流行病學調(diào)查等提供一種簡單、快速的分子生物學診斷方法，對有效預防控制ND具有重要意義。

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