糞腸球菌發(fā)酵生棉粕的工藝條件優(yōu)化*

馬珍，李呂木，，許發(fā)芝，丁小玲，錢坤，徐雅芫，陳麗園，張莉，陳文幫

1(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽 合肥，230036)

2(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，安徽 合肥，230036)

3(安徽省畜牧生物工程技術(shù)研究中心，安徽 合肥，230031)

4(安徽省獸藥飼料監(jiān)察所，安徽 合肥，230022)

棉粕為棉籽去油后的副產(chǎn)品，富含蛋白質(zhì)。但由于其中含有游離棉酚等抗?fàn)I養(yǎng)因子，限制了棉粕在動物生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用。因此，有效去除或降低棉粕中的棉酚，是改善其飼用品質(zhì)的關(guān)鍵。目前主要通過物理法、化學(xué)法、生物發(fā)酵法來降低或去除棉粕中的游離棉酚，物理和化學(xué)脫毒方法工藝設(shè)備要求高，增加了成本，同時對棉粕的營養(yǎng)價值也有不利影響。而微生物發(fā)酵降解游離棉酚具有以下優(yōu)勢:(1)生產(chǎn)成本低，不需要使用價格高昂的設(shè)備，不需加熱或者添加化學(xué)試劑，無化學(xué)殘留，應(yīng)用安全［1］;(2)除了對棉粕中游離棉酚有去除作用，同時對其他的抗?fàn)I養(yǎng)因子(如非淀粉多糖、單寧、植酸等)也有一定的去除作用;(3)增加棉粕中生物活菌數(shù)有利于動物腸道菌群的平衡幫助動物消化吸收，提高飼料利用率，同時發(fā)酵產(chǎn)生的酶可將大分子蛋白質(zhì)降解為小分子蛋白質(zhì)及小肽。對棉粕中游離棉酚微生物降解途徑主要采用固態(tài)發(fā)酵，且大多需對棉粕底物進(jìn)行滅菌處理［2－4］。然而，高溫高壓蒸煮滅菌本身會引起大部分棉酚由游離狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)合狀態(tài)［5］。因此，固態(tài)發(fā)酵棉粕降解游離棉酚一定程度上是高溫高壓的作用;另一方面，麩皮、玉米粉等輔料的添加會使游離棉酚含量相對下降。據(jù)報道，輔料添加、化學(xué)試劑和干燥過程中導(dǎo)致的棉酚含量直接和間接減少，真正微生物降解的棉酚含量要低于10%［6］。因此，對棉粕高溫高壓蒸煮處理后發(fā)酵降解游離棉酚存在高估單純微生物菌株對游離棉酚的降解能力，且在實(shí)際生產(chǎn)中蒸煮無疑會增加處理成本和生產(chǎn)工藝繁瑣程度，導(dǎo)致研究中所采用的發(fā)酵工藝很難做到規(guī)?；瘧?yīng)用。因此，采用固態(tài)發(fā)酵生棉粕的途徑降解游離棉酚受到重視［7－8］。從發(fā)酵類型看，生棉粕的固態(tài)好氧發(fā)酵和固態(tài)厭氧發(fā)酵兩種類型都具有較好的去除游離棉酚的效果［7－10］，但固態(tài)厭氧發(fā)酵相對好氧發(fā)酵工藝簡單，物料損耗小，更經(jīng)濟(jì)和便于實(shí)際應(yīng)用，具有更好的發(fā)展前景。厭氧發(fā)酵生棉粕的菌種多為兼性厭氧型，如酵母菌［10］，而糞腸球菌還未見報道。但糞腸球菌是國家農(nóng)業(yè)部允許使用的飼用微生物菌種，它屬于革蘭氏陽性球菌，無芽孢、無莢膜、生長代謝快，具有較好的黏附力，還可產(chǎn)生益生物質(zhì)細(xì)菌素［11］。本實(shí)驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，糞腸球菌EF24 具有良好的棉酚去除效果。此研究采用糞腸球菌EF24 對生棉粕進(jìn)行固態(tài)厭氧發(fā)酵，探索其去除游離棉酚的最佳發(fā)酵條件，以期為微生物發(fā)酵生棉粕提高飼用品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗材料

菌種為本實(shí)驗室篩選保藏的糞腸球菌EF24，棉粕購自新疆金鑫生物科技發(fā)展有限公司，水分含量11.37%，粗蛋白含量為47.25%，游離棉酚含量為638.60mg/kg。主要化學(xué)試劑有正己烷、異丙醇、3-氨基-1-丙醇、冰乙酸、苯胺，均為分析純。培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。主要儀器設(shè)備為:SW-CJ-2D 型雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司;41280型手提式壓力蒸汽滅菌鍋，上海華線醫(yī)用核子儀器公司;HZQ-F160A 型高低溫恒溫振蕩培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司;752 型紫外可見分光光度計，上海浦東物理光學(xué)儀器廠;DD-04 型高速中藥粉碎機(jī)，溫嶺市大德中藥機(jī)械有限公司。

1.2 實(shí)驗方法

將斜面菌種接種于50 mL 牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基上，37℃，120 r/min 培養(yǎng)24 h，活化菌種。然后取活化的菌液，以2%的接種量接到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37℃，120 r/min 培養(yǎng)24 h，制成發(fā)酵種子液。

固態(tài)厭氧發(fā)酵生棉粕:將糞腸球菌發(fā)酵種子液按2%接種量和1∶0.8 的料水比與1 000 g 棉籽粕基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基混勻(自然pH 值)，然后平均分裝到2 個8 號塑料袋，密封扎緊，37℃恒溫靜置培養(yǎng)5d。發(fā)酵結(jié)束，65℃烘干，粉碎，測定發(fā)酵樣游離棉酚含量。游離棉酚含量測定采用國標(biāo)苯胺法［12］，棉粕原樣和發(fā)酵棉粕游離棉酚含量均換算成為絕干基礎(chǔ)。

單因素試驗:在上面固態(tài)厭氧發(fā)酵生棉粕的基礎(chǔ)上，改變接種量、料水比、pH 值、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間中的一個因素，固定其他4 個因素，進(jìn)行單因素試驗。分別選擇發(fā)酵料水比、初始pH 值、發(fā)酵時間、接種量、發(fā)酵溫度作為影響發(fā)酵棉粕游離棉酚含量的主要因素，通過單因素試驗選取響應(yīng)面試驗的因素和水平。實(shí)驗設(shè)計見表1。

表1 單因素試驗設(shè)計Table 1 Single factor experiment design

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗

2.1.1 料水比對棉粕游離棉酚含量的影響

由圖1 可知當(dāng)料水比為1∶0.6 時發(fā)酵棉粕中游離棉酚含量最低，即游離棉酚降解率最大。隨著料水比比值增大，發(fā)酵底物水分含量升高，發(fā)酵棉粕中游離棉酚含量出現(xiàn)緩慢上升趨勢。底物適宜水分含量的重要性以及水分對生物合成和棉酚脫毒的影響歸因于它影響固體顆粒的物理特性。水分含量高雖然減少底物的通透性，限制了氧氣的傳遞［13－15］，有利于厭氧發(fā)酵，但對該菌降解游離棉酚而言，水分含量過高則是不利的，結(jié)果表明在料水比1∶0.6 有利于該菌對游離棉酚的降解?？赡茉诖藯l件下更加適合游離棉酚降解酶的產(chǎn)生，確切的機(jī)理有待進(jìn)一步研究。底物水分含量過低會引起底物營養(yǎng)物溶解性的減少以及底物顆粒的膨脹程度降低，從而影響發(fā)酵脫毒［16］。

圖1 料水比對棉粕游離棉酚含量的影響Fig.1 Effect of ratio of material to water on the content of free gossypol in cottonseed meal

2.1.2 初始pH 值對棉粕游離棉酚含量的影響

如圖2 所示，當(dāng)初始pH 為6.5 時游離棉酚含量最低，及棉粕游離棉酚降解效果最好?？赡茉诖俗钸mpH 值下游離棉酚與微生物分泌的氨基酸，或者活性蛋白質(zhì)中游離氨基結(jié)合，形成結(jié)合棉酚［17］或者微生物分泌的可降解棉酚的酶類，分解利用游離棉酚，從而使棉酚含量降低［18］。

圖2 初始pH 值對棉粕游離棉酚含量的影響Fig.2 Effect of initial pH on the content of free gossypol in cottonseed meal

2.1.3 發(fā)酵時間對棉粕游離棉酚含量的影響

如圖3 所示，發(fā)酵3d 時，棉粕游離棉酚含量最低，游離棉酚降解效果最好，隨著發(fā)酵時間延長，游離棉酚含量出現(xiàn)上升趨勢。這可能是由于微生物與發(fā)酵后培養(yǎng)基中其他化合物的相互作用，引起棉酚降解酶的變性或分解，還有部分結(jié)合棉酚轉(zhuǎn)化成游離棉酚［19］。

圖3 發(fā)酵時間對棉粕游離棉酚含量的影響Fig.3 Effect of fermentation time on the content of free gossypol in cottonseed meal

2.1.4 接種量對棉粕游離棉酚含量的影響

試驗結(jié)果(見圖4)表明，當(dāng)菌液接種量為4%時，發(fā)酵棉粕游離棉酚含量最低，游離棉酚降解率最高。大于4%接種量的底物反而使棉酚的降解率下降，這可能是由于高接種量可能引起微生物生長過度，從而導(dǎo)致棉酚降解酶分泌的抑制［20］。

圖4 接種量對棉粕游離棉酚含量的影響Fig.4 Effect of inoculation amount on the content of free gossypol in cottonseed meal

2.1.5 發(fā)酵溫度對棉粕游離棉酚含量的影響

發(fā)酵溫度的高低在發(fā)酵工藝中非常重要。在發(fā)酵初期，由于微生物生長代謝能力強(qiáng)，溫度升高很快，而固態(tài)發(fā)酵傳熱率差，物料溫度會在短時間內(nèi)急劇升高［21］。如果散熱不暢，將會導(dǎo)致熱量積聚，減少了微生物的活動，從而影響游離棉酚降解效果。如圖5 所示，發(fā)酵溫度為37℃時，發(fā)酵棉粕游離棉酚含量最低，游離棉酚降解率最高。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化

圖5 發(fā)酵溫度對棉粕游離棉酚含量的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on the content of free gossypol in cottonseed meal

響應(yīng)面試驗設(shè)計［22］采用SAS9.1 軟件，根據(jù)Box-Behnken 的中心組合試驗設(shè)計原理，選擇單因素試驗中對響應(yīng)值Y(游離棉酚含量)有顯著影響的因素作為自變量，采用3 因素3 水平的Box-Behnken 響應(yīng)面試驗設(shè)計法。以料水比、初始pH 值、發(fā)酵時間為自變量，分別以x1、x2、x3表示，并以+1、0、－1 分別代表自變量的高、中、低水平，按方程Xi=(xi－x0)/x對自變量進(jìn)行編碼，其中Xi為自變量的編碼值;xi為自變量的真實(shí)值;x0為試驗中心點(diǎn)處自變量的真實(shí)值;x為自變量的變化步長。試驗因素及水平見表2，試驗設(shè)計與試驗結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面設(shè)計試驗因素與水平Table 2 Factors and levels in response surface design

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Response surface design and corresponding results

2.2.1 方差分析

對表3 中游離棉酚含量的試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，分析結(jié)果見表4。從表4 可以看出，方程的決定系數(shù)為95.89%，表明用上述回歸方程描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系時，其因變量和全體自變量之間的線性關(guān)系顯著，該模型與實(shí)際實(shí)驗擬合較好。從表4 可以看出，以游離棉酚含量為響應(yīng)值所建立的回歸模型是較顯著的。方程一次項、二次項的影響顯著，表明各影響因素對游離棉酚含量都不是簡單的線性關(guān)系。由表4 中P值可知，各因素影響程度從大到小的依次排列為料水比、初始pH 和發(fā)酵時間。

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Analysis of variance for the fitted regression model equation

2.2.2 響應(yīng)曲面分析

由圖6 ～圖8 可知，響應(yīng)值隨著3 因素的上升而顯著增大，各因素值過高，響應(yīng)值又呈下降趨勢;初始pH 值與發(fā)酵時間交互作用較顯著，料水比與初始pH值、料水比與發(fā)酵時間交互作用較小，近似圓形，與表4 中交互項P值的分析結(jié)果一致。

為了確定各因素的最優(yōu)值，將所得回歸方程分別對各自變量取一階偏導(dǎo)等于零可得一個三元一次方程組:

39.242 5 +55.168 34X1+7.522 5X2+14.417 5X3=0

－12.558 75 +7.522 5X1+120.733 34X2+29.065X3=0

4.911 25 +14.417 5X1+29.065X2+31.513 34X3=0

圖6 游離棉酚含量與初始pH 值、發(fā)酵時間的響應(yīng)面圖及其等高線Fig.6 Response surface contour plots showing effect of initial pH and fermentation time on the content of free gossypol

圖7 游離棉酚含量與料水比、發(fā)酵時間的響應(yīng)面圖及其等高線Fig.7 Response surface contour plots showing effect of ratio of material to water and fermentation time on the content of free gossypol

圖8 游離棉酚含量與料水比、初始pH 值的響應(yīng)面圖及其等高線Fig.8 Response surface contour plots showing effect of ratio of material to water and initial pH on the content of free gossypol

求解方程組，可得模型極值坐標(biāo)為:X1= －0.745 48，X2=0.136 10，X3=0.059 69，即當(dāng)料水比為1:0.53，初始pH 值為6.57，發(fā)酵時間為3.06d 時游離棉酚含量最低為221.48 mg/kg。

2.2.3 回歸模型的驗證實(shí)驗

為了檢驗?zāi)Ｐ皖A(yù)測的準(zhǔn)確性，在最佳發(fā)酵條件(料水比1∶0.53，初始pH 值6.57，發(fā)酵3.06 d，接種量4%，37℃)下進(jìn)行4 次平行試驗，發(fā)酵棉粕游離棉酚含量分別為229.69 mg/kg，230.22 mg/kg，231.19 mg/kg，235.63 mg/kg，即平均游離棉酚含量為231.68 mg/kg 實(shí)驗值與理論值很接近，因此，該模型可用于預(yù)測固態(tài)發(fā)酵棉粕中游離棉酚降解情況。

3 結(jié)論

在料水比1∶0.53，初始pH 值6.57，發(fā)酵3.06 d，接種量4%，37℃的條件下，利用糞腸球菌EF24 厭氧固態(tài)發(fā)酵未經(jīng)滅菌的生棉籽粕，其游離棉酚可從720.52 mg/kg 降至250 mg/kg，達(dá)到小于300 mg/kg的低酚棉籽粕的標(biāo)準(zhǔn)［23］。此方法工藝簡單，不失為一種經(jīng)濟(jì)有效的降低棉粕含量的微生物發(fā)酵方法。

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