薏苡附子敗醬散抗肝癌作用的實(shí)驗(yàn)研究*

孫 燕 ，張露蓉 ，2△，姚 霏 ，2，陳 江

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬蘇州市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 蘇州 2150092.蘇州市吳門醫(yī)派研究院，江蘇 蘇州 215009）

肝癌是中國(guó)常見的消化道惡性腫瘤之一，病死率在腫瘤中居第2位[1]。由于肝癌的惡性程度及侵襲性高，多數(shù)患者確診時(shí)已經(jīng)為中晚期[2]，使得治療形勢(shì)不容樂觀[3-5]。中醫(yī)認(rèn)為，陽(yáng)氣虧虛、濕熱聚毒、氣滯血瘀等是肝癌發(fā)生的病理基礎(chǔ)[6]，具有寒、濕熱、瘀等特點(diǎn)。中醫(yī)藥治療寒、濕、瘀之病癥，注重辨證施治、扶正驅(qū)邪、調(diào)理氣機(jī)，以達(dá)到補(bǔ)陽(yáng)散寒、祛濕化瘀解毒的功效[7]。

薏苡附子敗醬散在《金匱要略·瘡癰腸癰浸淫病脈證并治》中有所記載，方中包括薏苡仁、附子、敗醬草3味藥，具有破瘀散結(jié)，溫補(bǔ)陽(yáng)氣的功效[8-10]，常用于由寒、濕、瘀所致的多種疾病的治療[11-14]。這與肝癌的發(fā)病機(jī)理所對(duì)癥。此外，有文獻(xiàn)報(bào)道君藥薏苡仁中的有效成分薏苡仁油可以抑殺肝癌細(xì)胞，并已制成康萊特注射液供臨床上使用[15]；附子提取物對(duì)移植性肝癌H22細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用[16]；黃花敗醬總皂苷、總黃酮類亦對(duì)腫瘤有一定的抑制作用[17]?？梢姡瑥闹嗅t(yī)病因和單味藥角度，薏苡附子敗醬散可拓展應(yīng)用于肝癌的治療。臨床上，對(duì)肝癌的治療雖未見報(bào)道，但應(yīng)用此方加味聯(lián)合化療治療大腸癌頗有成效[18]。因此，本文圍繞薏苡附子敗醬散，探討其抗肝癌的效應(yīng)及有可能的作用機(jī)理，為該方臨床用于抗肝癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，亦為臨床合理使用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 儀器基礎(chǔ)電泳儀電源（北京百晶生物技術(shù)有限公司）；酶標(biāo)儀（Molecular Devices公司）；FACS Calibur流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)ProteinSimple公司）。

試劑 DMEM培養(yǎng)液（GIBCO公司，批號(hào)：1993895）；胎牛血清（杭州天杭生物科技股份有限公司，批號(hào)：18120503）；胰蛋白酶（閃晶生物公司，批號(hào)：2594141）；二甲亞砜（天津DAMAO化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20150906）；順鉑（齊魯制藥有限公司，批號(hào)：AA1A8028B）；四甲基偶氮唑鹽（BioFROXX公司，批號(hào)：EZ2811A179）；Annexin V-PE 細(xì)胞凋亡試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20180518）；BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：P0010）；ECL檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：20180228）；β-actin（CMCTAG 公司，批號(hào)：1832NJ）；Caspase-3、cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2抗體（Cell Signaling公司，批號(hào)分別為：0012，0037，0005，0005）。

藥材 薏苡仁（批號(hào)產(chǎn)地：190306河北）；附片（黑順片）（批號(hào)產(chǎn)地：190306四川）；敗醬草（批號(hào)產(chǎn)地：190306河北）。購(gòu)自于蘇州市春輝堂藥業(yè)有限公司。

細(xì)胞株及動(dòng)物 小鼠肝癌細(xì)胞株Hepa1-6由蘇州大學(xué)生命科學(xué)院饋贈(zèng)。SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自蘇州昭衍新藥研究中心有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（JING）2014-0004。

1.2 藥液制備 按經(jīng)方比例稱取薏苡仁30 g，附子6 g，敗醬草15 g，按照 8倍量純水冷浸30 min，回流提取1 h，傾出藥液；藥渣再按6倍量加入純水，回流提取30 min，傾出藥液。將兩次藥液進(jìn)行減壓濃縮，最終至生藥含量1 g/mL，冷藏備用。

1.3 荷瘤小鼠模型建立及給藥 參照實(shí)驗(yàn)室建立的方法制備荷瘤小鼠模型[19]：用 PBS把Hepa1-6肝癌細(xì)胞密度調(diào)整為1×107個(gè)/mL，然后取0.2 mL的細(xì)胞懸液接種于C57 BL/6小鼠的腋下，建立模型。種瘤8～10 d之后觀察成瘤情況。將成瘤小鼠分為模型組、順鉑陽(yáng)性藥物組（5 mg/kg），薏苡附子敗醬散低、高劑量組（7.735、15.47 g/kg），每組6只小鼠。灌胃給藥，持續(xù)14 d，每天1次，最后1次給藥12 h后，處死小鼠，測(cè)定瘤重。抑瘤率 =［1-（給藥組瘤重/對(duì)照組瘤重）］×100%。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) Hepa1-6肝癌細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素的 DMEM（pH 7.0）完全培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24 h更換1次培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，用0.25%胰酶進(jìn)行消化、傳代，取第3～4代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hepa1-6細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.5 MTT檢測(cè)細(xì)胞活力 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hepa1-6細(xì)胞，接種于96孔板。分別加入不同生藥濃度（10、20、30、40、50 mg/mL）的薏苡附子敗醬散藥液并作用24、48、72 h。以不加藥物為空白組，順鉑（50 μg/mL）為陽(yáng)性藥物組。加入MTT后培養(yǎng)4 h，棄去上清，加入DMSO，在酶標(biāo)儀490 nm得到吸光度OD（λ）值。細(xì)胞增殖抑制率=［（1-給藥組OD值/對(duì)照組OD值）］×100%。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將Hepa1-6肝癌細(xì)胞接種于6孔板，給藥組分別加入不同生藥濃度的薏苡附子敗醬散（10、20、30、40、50 mg/mL），空白組不加藥，培養(yǎng)48 h后分別加入Annexin V和FITC進(jìn)行染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.7 Western blot檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hepa1-6肝癌細(xì)胞，接種于6孔板。給藥組分別加入30、40、50 mg/mL生藥濃度的薏苡附子敗醬散，空白組不加入藥物，培養(yǎng)48 h。裂解，離心，提取蛋白，用BCA法定量；SDS-PAGE電泳；PVDF膜轉(zhuǎn)膜，封閉；一抗（1∶1 000稀釋）4℃孵育過(guò)夜，TBST漂洗，二抗（1∶1 000）室溫孵育 1 h，TBST漂洗；ECL 曝光、顯影。以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 薏苡附子敗醬散體內(nèi)外對(duì)Hepa1-6細(xì)胞的抗肝癌效應(yīng) 觀察薏苡附子敗醬散在體內(nèi)抗腫瘤作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，與模型對(duì)照組瘤重（1.83±0.72）g相比，7.735、15.47 g/kg薏苡附子敗醬散組瘤重分別為（1.21±0.33）g 和 （0.79±0.33）g，抑瘤率分別為 （33.78±17.85）%、（56.95±18.17）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。隨著薏苡附子敗醬散劑量的增加，瘤重減小，抑瘤率增大，表明薏苡附子敗醬散對(duì)Hepa1-6荷瘤小鼠腫瘤的生長(zhǎng)具有抑制作用，見圖1A、1B。

從體外對(duì)Hepa1-6肝癌細(xì)胞增殖抑制的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，隨著給藥濃度以及作用時(shí)間的增加，抑制率增加，并呈一定的劑量-時(shí)間依賴關(guān)系，見圖1C。以上結(jié)果表明薏苡附子敗醬散體內(nèi)外均具有抗肝癌效應(yīng)。

圖1 薏苡附子敗醬散體內(nèi)外對(duì)Hepa1-6細(xì)胞的抗肝癌效應(yīng)

2.2 薏苡附子敗醬散對(duì)Hepa1-6細(xì)胞凋亡的影響 為了探究薏苡附子敗醬散的抗肝癌機(jī)理，檢測(cè)了對(duì)Hepa1-6細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，隨著薏苡附子敗醬散濃度的增加，凋亡率逐漸上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明薏苡附子敗醬散可促進(jìn)Hepa1-6細(xì)胞凋亡，并有劑量依賴性，見圖2。

圖2 薏苡附子敗醬散對(duì)Hepa1-6細(xì)胞凋亡的影響

2.3 薏苡附子敗醬散對(duì)Caspase-3、cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響 由于薏苡附子敗醬散對(duì)Heap1-6細(xì)胞具有促凋亡作用，因此隨后檢測(cè)了凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)與空白組相比，隨著薏苡附子敗醬散濃度的增加，促凋亡蛋白Bax、Caspase-3、cleaved Caspase-3 表達(dá)升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下降（見圖3A、3B），Bax/Bcl-2值上升（見圖3C），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說(shuō)明薏苡附子敗醬散通過(guò)調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)來(lái)促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡，見圖3。

圖3 薏苡附子敗醬散對(duì)Hepa1-6細(xì)胞中凋亡蛋白表達(dá)的影響

3 討論

肝癌在中醫(yī)藥史上屬于“癥瘕”“脅肋脹痛”等范疇[20]，歷代醫(yī)家對(duì)其有一定的記錄，如“肝脈微急為肥氣，在脅下”“伏梁，環(huán)臍而痛”等[21]，并認(rèn)為肝癌是由正虛邪實(shí)、內(nèi)外交爭(zhēng)引起的，陽(yáng)氣不足、瘀毒濕熱是形成肝癌的病因[22-23]。薏苡附子敗醬散中薏苡仁和敗醬草化濕消腫散結(jié)、瀉火解毒化瘀，再加上附子性熱味辛、助陽(yáng)祛寒，通達(dá)經(jīng)絡(luò)，行郁滯之氣，增強(qiáng)薏苡仁和敗醬草的滲濕、除瘀、散結(jié)之功，共達(dá)散寒助陽(yáng)、化瘀祛濕之效[24]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，該方有消炎止痛、抑制腫瘤生長(zhǎng)的功效[24-25]，并且方中3味單藥均有抗肝癌效應(yīng)[15-17]，提示薏苡附子敗醬散在抗肝癌方面有應(yīng)用潛能。因此，在應(yīng)用C57 BL/6荷瘤小鼠模型評(píng)價(jià)該方的體內(nèi)抗肝癌效應(yīng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)該方可以降低荷瘤小鼠的瘤重，抑制腫瘤生長(zhǎng)。通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，該方能夠抑制Hepa1-6細(xì)胞增殖，體現(xiàn)出一定的肝癌抑制效應(yīng)。綜上結(jié)果，表明該方對(duì)肝癌的生長(zhǎng)具有抑制作用。

誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是抗肝癌機(jī)制之一[26-27]。研究表明，肝癌細(xì)胞在體內(nèi)外因素的影響下，經(jīng)過(guò)相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控，使細(xì)胞發(fā)生特性改變從而誘導(dǎo)凋亡[28]。從流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，薏苡附子敗醬散可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，說(shuō)明該方通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡來(lái)抑制增殖。Bcl-2家族中Bcl-2和Bax分別為抑制和促進(jìn)凋亡的兩個(gè)核心蛋白[29]，Bax/Bcl-2值是判斷線粒體外膜通道穩(wěn)定與否和細(xì)胞凋亡發(fā)生與否的重要評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)[30]。Caspases家族有10個(gè)成員，分為凋亡起始者和執(zhí)行者[31]。其中Caspase-3具有抑制劑特異性，降解PARP、DFF-45，抑制DNA的修復(fù)并啟動(dòng)DNA的降解，參與細(xì)胞凋亡的執(zhí)行[32]；而Caspase-3活化產(chǎn)生的cleaved Caspase-3，其表達(dá)程度可反映Caspase-3的活性和細(xì)胞凋亡情況[33]。進(jìn)一步研究其促凋亡作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)薏苡附子敗醬散組可使Bax表達(dá)升高，Bcl-2表達(dá)下降，Bax/Bcl-2值上升，同時(shí)可調(diào)控Caspase-3、cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)，且有劑量依賴效應(yīng)。綜上表明，薏苡附子敗醬散可能通過(guò)調(diào)控線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)Hepa1-6肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。

本研究結(jié)果顯示，薏苡附子敗醬散動(dòng)物體內(nèi)能抑制腫瘤生長(zhǎng)，體外能抑制Hepa1-6細(xì)胞增殖，并且誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。其機(jī)制可能與調(diào)控Bax、Bcl-2、Caspase-3、cleaved Caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)相關(guān)。本研究為薏苡附子敗醬散抗肝癌的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但是，薏苡附子敗醬散抗肝癌具體機(jī)制和特點(diǎn)尚未完全闡明，另外，給藥途徑為口服的中藥復(fù)方，本文只用水提液進(jìn)行體外細(xì)胞試驗(yàn)，對(duì)于評(píng)價(jià)其臨床活性還有所欠缺。因此薏苡附子敗醬散抗Hepa1-6肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)作用未來(lái)能否轉(zhuǎn)化為臨床用于肝癌的治療還需要進(jìn)一步研究。