基于網(wǎng)絡(luò)藥理學探討銀翹散治療上呼吸道感染的作用機制*

廖 陳，夏霜莉，李秀芳，代 蓉

（云南中醫(yī)藥大學藥理教研室，云南 昆明 650500）

上呼吸道感染（upper respiratory tract infection，URTI）簡稱“上感”，是自鼻腔至咽喉部急性炎癥的總稱，具有易傳染、發(fā)病率高的特點。URTI常在氣候驟變時易于流行，大部分由流感病毒、鼻病毒、冠狀病毒和呼吸道合胞病毒等病原體感染引起，感染過程持續(xù)發(fā)展可誘發(fā)支氣管炎、中耳炎、肺炎等并發(fā)癥，嚴重者甚至出現(xiàn)呼吸窘迫綜合征和呼吸衰竭[1]。據(jù)統(tǒng)計，呼吸系統(tǒng)疾病仍居于人口死亡率的第4位，且患病率呈逐年上升趨勢[2]。目前，對于URTI的防治，臨床常用解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥進行對癥治療，采用流感病毒疫苗接種進行預防，但病毒具有種類多、變異速度快的特點，使疫苗接種難以取得理想效果[3-4]。因此，尋找有效防治URTI的藥物具有重要意義。

銀翹散始載于溫病學家吳鞠通的《溫病條辨》由金銀花、連翹、桔梗、薄荷等中藥組成，具有辛涼透表、清熱解毒的功效，主治風溫初起，頭痛口渴，咳嗽咽痛等。臨床常用于治療呼吸道感染、肺炎、水痘、麻疹、猩紅熱等感染性疾病?，F(xiàn)代藥理研究表明，銀翹散具有抗炎止痛[5]、抑制病毒[6]和調(diào)節(jié)免疫[7]等作用，但其具體機制仍待探究?；谥兴帍头骄哂卸喑煞?、多途徑、多靶點治療疾病的特點，可通過借助數(shù)據(jù)挖掘以及靶點預測等多種手段，從系統(tǒng)的角度剖析藥效物質(zhì)與相關(guān)疾病之間特定節(jié)點的相互作用，多層次、多角度地闡述中藥復方的整體調(diào)節(jié)作用機制[8]。本研究將采用網(wǎng)絡(luò)藥理學的方法，通過獲取銀翹散防治URTI的主要活性成分、作用靶點和信號通路，構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，進而深入挖掘銀翹散治療URTI的可能作用機制，并為臨床應用銀翹散防治URTI提供依據(jù)。

1 數(shù)據(jù)與方法

1.1 獲取銀翹散化學成分及篩選活性成分 通過中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）[9]（http：//www.tcmspw.com/tcmsp.php）檢索銀翹散中金銀花、連翹、薄荷、牛蒡子等多味中藥所含的化學成分，對所有成分進行初步篩選，依據(jù) 藥 物 ADME（absorption，distribution，metabolism，excretion）特性，以口服生物利用度（oral bioactivity，OB）和藥物相似性（drug-likeness，DL）作為篩選指標，設(shè)置OB≥30%，DL≥0.18為篩選標準，確定符合條件的活性成分。

1.2 預測銀翹散潛在靶點 基于TCMSP數(shù)據(jù)庫，將銀翹散中的活性成分與相應靶點逐一匹配，運用U－niprot數(shù)據(jù)庫（http：//www.uniprot.org/）[10]和 PubMed數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）查詢與靶點蛋白相應的官方基因名，物種限定為“Homo sapiens”，進行標準化處理。

1.3 獲取URTI疾病相關(guān)靶點 以“upper respiratory tract infection”為關(guān)鍵詞，在 Online Mendelian Inheritance In Man（OMIM）（http：//www.omim.org/）[11]數(shù)據(jù)庫和 GeneCards（https：//www.genecards.org/）[12]數(shù)據(jù)庫中進行檢索，獲取上呼吸道感染的相關(guān)疾病靶點。

1.4 構(gòu)建“成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò) 利用Venn在線平臺（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）繪制“藥物-疾病”韋恩圖，獲取藥物和疾病共有靶點。將銀翹散的活性成分與相應疾病靶點導入Cytoscape軟件[13]中，構(gòu)建“成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)，得到銀翹散成分和上感疾病靶點的網(wǎng)絡(luò)圖?；诠?jié)點、邊、關(guān)聯(lián)性設(shè)置不同顏色，節(jié)點（node）表示活性成分和作用靶點，邊（edge）表示2個節(jié)點之間的相互作用。

1.5 構(gòu)建蛋白網(wǎng)絡(luò)互作圖 將銀翹散和URTI的共有靶點導入STRING在線平臺（http：//string-db.org）[14]，種屬選擇為“Homo sapiens”，置信區(qū)間設(shè)置為大于0.7，保存相應文本分析結(jié)果并導入Cytoscape，實現(xiàn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的可視化。

1.6 生物學過程與通路富集分析 為了分析銀翹散治療URTI的生物學過程和細胞信號通路傳導過程，繼而進一步闡明銀翹散的作用機制，將銀翹散治療URTI的作用靶點導入DAVID數(shù)據(jù)庫（http：//david.ncifcrf.gov/）[15]，物種限定為“Homo sapiens”，設(shè)定 P＜0.01，進行生物過程（biological process，BP）、細胞組分 （cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedoa of Genes and Genomes，KEGG） 富集分析[16]，并選取排名前15的分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 銀翹散中有效活性成分及潛在靶點的收集與篩選 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取銀翹散所含的化學成分，設(shè)置OB≥30%，DL≥0.18為篩選標準，以確定金銀花、連翹、薄荷、牛蒡子、甘草、荊芥穗、淡豆豉、桔梗和蘆根分別含有 23、23、10、2、92、8、2、7 和 1 個有效活性成分。主要活性成分包括了連翹脂（（-）-phillygenin）、木犀草素（luteolin）、槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaemferol）、連翹醇（forsythinol）、6-羥基黃酮（6-monohydroxyflavone）、蘆薈大黃素（aloe-emodin）、豆甾醇（stigmasterol）等。由于不同中藥可能存在相同活性成分和共同靶點，祛除重復值后，銀翹散全方共獲得150個有效化學成分和162個潛在靶點，舉例OB值排名前十的化合物（表1）。

2.2 URTI疾病靶點篩選 以“upper respiratory tract infection”為關(guān)鍵詞，通過OMIM和GeneCards數(shù)據(jù)庫分別檢索獲得154個和4 988個疾病相關(guān)靶點，祛除重復值后，共獲得5 103個疾病相關(guān)靶點。

2.3 構(gòu)建“成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò) 通過上述在線數(shù)據(jù)庫的篩選，獲取銀翹散的藥物作用靶點共162個，URTI的疾病相關(guān)靶點共5 103個，繼而取其交集部分靶點，明確“藥物-疾病”共同靶點117個，即藥物作用于疾病的潛在作用靶基因。將銀翹散150個活性成分及117個“藥物-疾病”共同靶點的對應文本信息導入Cytoscape軟件中，構(gòu)建“成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)（圖1），共有336個節(jié)點和3 758條邊，其中不同顏色三角形代表不同中藥所含成分，藍色長方形代表成分對應的靶點。

表1 銀翹散中OB值排名前10的化合物基本信息

圖1 “成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)

2.4 構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò) 基于STRING數(shù)據(jù)庫，將117個共同靶點進行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以文本形式導出，然后導入Cytoscape 3.7.2軟件中以實現(xiàn)可視化，節(jié)點大小代表該節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中的重要程度（圖2）。由圖可見，銀翹散活性成分主要作用于白介素6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤蛋白 P53（tumor protein P53，TP53）、絲裂原活化蛋白激酶 1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、淀粉樣蛋白（amyloid beta precursor protein，APP）、血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）等靶基因，提示銀翹散的活性成分可通過同時作用于多個靶點來影響和干預疾病的發(fā)展進程。

圖2 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

表2 靶基因GO富集分析

2.5 生物學過程和通路富集分析 對銀翹散治療URTI的核心靶點進行GO和KEGG富集分析，以P＜0.01為篩選指標，富集出顯著生物學過程和通路。GO富集分析包括了生物過程（BP）、細胞組分（CC）和分子功能（MF）3個部分。BP主要富集在外部刺激及小分子代謝過程的調(diào)節(jié)，主要涉及藥物、缺氧、有毒物質(zhì)相關(guān)的應激反應，炎癥反應，信號傳導，細胞的增殖遷移和凋亡等；CC主要涉及在細胞外空間、質(zhì)膜、細胞表面、受體復合物、細胞外基質(zhì)等；MF主要涉及酶結(jié)合、絲氨酸性內(nèi)肽酶活性、蛋白質(zhì)結(jié)合和蛋白酶結(jié)合等（表2）。KEGG分析結(jié)果顯示銀翹散治療URTI共涉及121條通路，選取前15條相關(guān)通路（表3），主要涉及TNF信號通路、PI3K/Akt信號通路、HIF-1信號通路等、Toll樣受體信號通路等，這些通路主要與炎癥反應、氧化應激、免疫調(diào)節(jié)、細胞凋亡相關(guān)（圖3）。結(jié)果表明銀翹散可通過多靶點、多環(huán)節(jié)的途徑治療上呼吸道感染。

表3 靶基因KEGG富集分析

圖3 銀翹散治療URTI的相關(guān)信號通路

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學突破了“一個藥物、一個靶點、一種疾病”的傳統(tǒng)藥物研發(fā)模式，通過采集數(shù)據(jù)信息，構(gòu)建“成分-疾病-靶點”相關(guān)網(wǎng)絡(luò)，系統(tǒng)分析藥物對疾病的干預與影響，從而揭示藥物“多成分、多途徑、多靶點”協(xié)同作用于人體的分子機制[17]。本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學的方法，篩選了銀翹散的活性成分群、潛在作用靶點及相關(guān)信號通路，為揭示銀翹散治療呼吸道感染的作用機制研究提供新策略和科學依據(jù)。

本研究首先通過TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取銀翹散所含的化學成分，確定了金銀花、連翹、薄荷、牛蒡子、甘草、荊芥穗、淡豆豉、桔梗和蘆根分別含有23、23、10、2、92、8、2、7 和 1 個有效活性成分。其主要活性成分包括了連翹脂、木犀草素、槲皮素、山柰酚、連翹醇、6-羥基黃酮、蘆薈大黃素和豆甾醇等。實驗研究表明，銀翹散中君藥金銀花、連翹主要含有的木犀草素可有效抑制甲型流感病毒（influenza A virus，IAV）衣殼蛋白I復合物的表達，阻止IAV進入機體[18]，同時還可抑制M1巨噬細胞的極化，減少IL-6、IL-12和TNF-α等炎癥因子的生成[19]，有效減輕呼吸道的炎癥反應。槲皮素可通過與呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）中M2-1蛋白的重要結(jié)構(gòu)域相互作用，有效阻止RSV的復制和增殖，進而抑制病毒感染宿主[20]。山柰酚、連翹脂、豆甾醇等化合物不僅具有抗炎、抗氧化應激，還有抗菌、抗病毒的作用[21-23]，提示銀翹散中的活性成分可通過協(xié)同作用的方式發(fā)揮治療URTI的作用。

通過明確“藥物-疾病”的117個交集靶點，然后將117個共同靶點進行蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖分析，結(jié)果提示銀翹散治療URTI的核心靶基因主要包括IL-6、TNF、TP53、MAPK1等。靶基因的 GO 和 KEGG 富集分析結(jié)果表明，GO功能主要涉及炎癥反應、氧化應激、免疫應答、細胞的增殖、分化和凋亡等生物過程，KEGG分析結(jié)果主要富集在Toll樣受體、TNF、PI3K/Akt、HIF-1 等信號通路（圖 3）。其中，Toll樣受體信號通路負責識別感染源表面的模式蛋白并產(chǎn)生先天免疫應答，當氣道發(fā)生炎癥反應時，這條通路是連接先天免疫反應和適應性免疫的關(guān)鍵橋梁[24]；HIF-1α是HIF-1信號通路中的一種氧依賴性轉(zhuǎn)錄激活因子，在激活狀態(tài)下可促使發(fā)生氧化應激和炎癥反應[25]。Toll樣受體和HIF-1α均可激活NF-κB信號通路，促進炎癥因子如TNF-α、IL-1β和IL-6的釋放，加重呼吸道的炎癥反應，破壞呼吸道黏膜上皮屏障[26-28]。此外，TLRs可促進氣道上皮細胞中III型干擾素和IL-6的釋放，進一步激活T細胞受體信號通路，調(diào)節(jié)機體的免疫功能，抵御病原微生物的入侵。TNF信號通路主要參與細胞的生長、增殖、炎癥及免疫反應，激活狀態(tài)下的TNF信號通路能夠刺激NF-κB入核，進而激活NF-κB信號通路，促進TNF-α和IL-6等炎癥因子的釋放，誘導炎癥級聯(lián)反應，損傷氣道上皮細胞，從而引起或加重機體的炎癥反應。閆樹麗[29]通過建立幼齡小鼠呼吸道合胞病毒肺炎模型，證實銀翹散和玉屏風散可通過降低NF-κB和TNF-α的表達水平，有效的抑制炎癥反應，防止呼吸道合胞病毒對肺組織的損傷。PI3K/Akt作為經(jīng)典的信號通路，在細胞生長、增殖、凋亡中起到關(guān)鍵性的作用，當呼吸道受到感染時，PI3K調(diào)控的下游通路被激活，進一步影響絡(luò)氨酸激酶、整合素、B細胞和T細胞受體的應答反應，調(diào)節(jié)機體的免疫功能。由此可見，銀翹散可通過調(diào)控上述相關(guān)信號通路，減輕炎癥反應、調(diào)節(jié)免疫應答，從而改善呼吸道感染的狀況。

綜上所述，本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學挖掘了銀翹散治療上呼吸道感染的活性成分、潛在靶點及作用途徑，結(jié)果表明銀翹散含有連翹脂、木犀草素、槲皮素、山柰酚、連翹醇、豆甾醇等活性成分，這些活性成分作用于 IL-6、TP53、MAPK1、TNF 等關(guān)鍵靶點，起到抗炎、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫、修復道粘膜屏障的作用，主要通過干預 Toll樣受體、TNF、HIF-1、PI3K/Akt等信號通路發(fā)揮作用，銀翹散治療上呼吸道感染作用機制的數(shù)據(jù)挖掘可為后續(xù)的實驗研究提供理論依據(jù)及指導。