區(qū)分肌纖維類型的異染ＡＴＰａｓｅ法改良研究

王月麗　周　越　王瑞元　劉桂華　馮科宇

摘要：目的：完善區(qū)分肌纖維類型的異染ATPase染色方法，為相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究提供借鑒和參考。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：染色方案一可顯示4種肌纖維類型：I、IIA、IIB和IIC。大鼠骨骼肌在預(yù)孵育液pH值4.35左右時(shí)，出現(xiàn)最佳染色結(jié)果；而蟾蜍骨骼肌在預(yù)孵育液pH值4.40～4.70都出現(xiàn)了較佳的染色結(jié)果。染色方案二只能區(qū)分3種肌纖維類型：I、IIA和IIB。出現(xiàn)較佳結(jié)果時(shí)，大鼠和蟾蜍預(yù)孵育液的pH值也不同。結(jié)論：異染腺苷三磷酸酶法區(qū)分骨骼肌纖維類型，染色方案一可區(qū)分四種肌纖維類型，而染色方案二可區(qū)分三種肌纖維類型；出現(xiàn)最佳染色結(jié)果時(shí)，大鼠和蟾蜍骨骼肌的染色條件稍有不同，存在種屬差異。

關(guān)鍵詞：肌纖維類型；骨骼?。划惾鞠佘杖姿崦福ˋTPase）法；甲苯胺藍(lán)

中圖分類號(hào)：G804.21文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1007-3612(2008)05-0610-03

肌纖維類型有不同的分型標(biāo)準(zhǔn)，采用組織化學(xué)染色方法，根據(jù)肌纖維ATP酶染色方法，可以將肌纖維分為I型（慢?。?、II型（快?。?，II型纖維又進(jìn)一步分為A、B、C三種亞型。經(jīng)典的方法是在1955年由Padykula and Herman［1］首次報(bào)道 ，把肌纖維區(qū)分為I型和II型，后來(lái)又經(jīng)Guth and Samaha［2］（1969）和Brook and Kaiser［3］(1970)及別的學(xué)者改良，可以區(qū)分I、IIA和IIB型三種肌纖維，但需要連續(xù)切片，并且需要在不同pH值的溶液中分別孵育不同的次數(shù)，相鄰切片之間對(duì)比才能區(qū)分出不同的肌纖維類型。1977年Tunell and Hart［4］報(bào)道在同一張切片上可以區(qū)分出3種肌纖維類型：I、IIA和IIB。1983年Doriguzzi C等［5］ 又有所改進(jìn)，用陽(yáng)離子染料甲苯胺藍(lán)和天青A染色，I、IIA和IIB型分別為綠松石色（turquoise），淺紫羅蘭色（light violet ），和深紫羅蘭色（dark violet），用水性介質(zhì)封片后，染料很快就會(huì)擴(kuò)散，顏色褪去。用酒精脫水中性樹(shù)膠封片后，顏色變?yōu)樯顪\不一的藍(lán)色，出現(xiàn)了異染到正染的轉(zhuǎn)移。以上學(xué)者的方案都沒(méi)有很好的區(qū)分出IIC型纖維。1990年，Ogilvie and Feeback［6］用人骨骼肌標(biāo)本首次描述了異染腺苷三磷酸酶法能夠在一張切片上同時(shí)區(qū)分I、IIA、IIB和IIC4種肌纖維類型的方法，并且乙醇脫水中性樹(shù)膠封片后異染的顏色不褪色，可以長(zhǎng)期保持。該方案后來(lái)又經(jīng)Konishi M 等［7］（2000年）改良。因課題需要區(qū)分大鼠骨骼肌的肌纖維類型，采用了Ogilvie and Feeback［6］的方法，但并未出現(xiàn)原文所描述的染色結(jié)果，又參考Konishi M等［7］的方法，將預(yù)孵育液的pH值重新調(diào)整后，終于出現(xiàn)了較佳的染色結(jié)果。鑒于以前的學(xué)者取材對(duì)象都是哺乳動(dòng)物，為了證實(shí)種屬差異的存在和尋找最佳的染色條件，在參照相關(guān)文獻(xiàn)［6,7］的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了如下實(shí)驗(yàn)。

1材料和方法

1.1取材和切片10周齡SD大鼠、蟾蜍（購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部）。大鼠稱重后，戊巴比妥鈉腹腔麻醉（5 mg/100 g），迅速分離大鼠腓腸??；破壞蟾蜍的腦組織和脊髓后迅速分離腓腸肌。分別小心剪取約3×3×5 mm的腓腸肌（切勿牽拉），O．C．T.（Lab-Tek Products，Naperville）包埋，投入用液氮預(yù)冷的裝有異戊烷（-70℃）的小燒杯中驟冷后用錫紙包好放入液氮中保存，用時(shí)移入恒冷切片機(jī)（-20℃）內(nèi)。切片厚度10 μm，自然晾干或吹風(fēng)機(jī)冷風(fēng)吹干備用。

1.2配制溶液1）預(yù)孵育液：蒸餾水475 mL，醋酸鉀2.45 g，CaCl₂·2H₂O1.30g，用冰醋酸調(diào)pH至實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求后加蒸餾水至500 mL。

本研究設(shè)定的預(yù)孵育液的pH值如下，

大鼠腓腸肌標(biāo)本：4.25，4.30，4.35，4.40，4.45，4.50，4.60，4.65。

蟾蜍腓腸肌標(biāo)本：4.35，4.40，4.45，4.50，4.55，4.60，4.65，4.70。

2）Tris緩沖液①：蒸餾水950 mL，Trizma堿（Sigma）12.10 g，CaCl₂·2H₂O2.60 g。

Tris緩沖液②：蒸餾水950 mL，Tris12.10 g，CaCl₂·2H₂O2．60 g。

分別用1N的HCl調(diào)pH至7.80后，加蒸餾水至1 000 mL。

3）孵育液①：蒸餾水30 mL，氯化鉀185 mg，ATP二鈉鹽（Sigma）76 mg，氯化鈣溶液（0.18M）5 mL，Sigma221(1.5M，2-amino-2-methyl-1-propanol)緩沖液3.35 mL。用1N或0．5N的HCl調(diào)pH至9.40，加蒸餾水至50 mL。

孵育液②：蒸餾水30 mL，ATP二鈉鹽（Amresco）125 mg，巴比妥鈉（0.1M）10 mL，氯化鈣溶液（0.18M）5 mL。用1N或0.1 N的NaOH調(diào)pH至9.40，加蒸餾水至50 mL。

4）0.1%甲苯胺藍(lán)（Chroma）水溶液。

5）1%的CaCl₂·2H₂O溶液。

所用試劑沒(méi)有標(biāo)出的均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3染色步驟

1.3.1染色方案一（參考Ogilvie and Feeback［6］等的方案，有所改動(dòng)）1）切片入預(yù)孵孵育液，室溫2 min。

溶液的pH值是決定染色結(jié)果的關(guān)鍵因素，而預(yù)孵育液的pH決定了不同類型的肌纖維中ATP酶抑制的程度，也決定了酶活性部位磷酸鹽沉淀的濃度，從而最后決定著染色的結(jié)果。鑒于前人所確定的染色方案已相對(duì)成熟，其中關(guān)鍵因素是預(yù)孵育液pH值的不同，所以本研究主要是改變預(yù)孵育液的pH值，觀察染色結(jié)果。

2） Tris緩沖液①換洗3次，每次2 min。目的是去除組織中殘留的酸性的預(yù)孵媒介，終止反應(yīng)，使其對(duì)孵育液的影響最小。

3） 入孵育液①，室溫25 min。

4） 1%CaCl₂·2H₂O水溶液內(nèi)換洗3次，每次上下提拉切片4次。以除去在ATP-ATPase反應(yīng)中未結(jié)合的磷酸。這影響到其后染色的背景干凈與否。

5） 0.1%甲苯胺藍(lán)水溶液內(nèi)染色90 s或1%甲苯胺藍(lán)水溶液內(nèi)染色10 s（0.1%的更易控制染液濃度和染色時(shí)間）。

6）流動(dòng)的蒸餾水沖洗切片，最多30 s；或用500 mL燒杯盛蒸餾水，洗去多余染液。

7）快速脫水：95%酒精換1次，上下提拉切片3～5次；再經(jīng)無(wú)水酒精2次，每次上下提拉切片3～5次。此步驟宜快，以保持色調(diào)。

8） 二甲苯透明，換兩次，每次5 min(因二甲苯為有毒藥品，此步驟宜在通風(fēng)櫥中進(jìn)行，省去此步驟對(duì)結(jié)果影響不大)。

9） 中性樹(shù)膠封片。

1.3.2染色方案二采用價(jià)廉的Tris緩沖液②和孵育液②，其余試劑和步驟與染色方案一完全相同。

2結(jié)果

I-型纖維綠松石（turquoise）色，即藍(lán)綠色，IIA-型纖維淡粉紅色(light pink)，IIB-型纖維紫羅蘭 (violet) 色，IIC-型纖維深藍(lán)色(dark blue)。

2.1染色方案一大鼠的腓腸肌標(biāo)本在預(yù)孵液pH值為4．35～4.40出現(xiàn)了最佳的染色結(jié)果，可以區(qū)分四種肌纖維類型：I、IIA、IIB和IIC，其它pH值只能區(qū)分三種肌纖維類型：I、IIA、和IIB；蟾蜍腓腸肌標(biāo)本在預(yù)孵液pH值4.40～4.70之間都出現(xiàn)了較好的染色效果，色調(diào)稍有差別，但都可區(qū)分四種肌纖維類型(圖1①-④)。

2.2染色方案二在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的pH值范圍內(nèi)都只能區(qū)分出三種肌纖維類型：I、IIA和IIB，沒(méi)有區(qū)分出IIC型纖維。大鼠的腓腸肌標(biāo)本在預(yù)孵液pH值為4.30-4.45之間可以區(qū)分三種肌纖維類型，而其它pH值不能很好的區(qū)分I型和II型纖維；蟾蜍腓腸肌標(biāo)本在預(yù)孵液pH值4.40-4.70之間都可區(qū)分3種肌纖維類型(圖1⑤-⑥)。

3討論

3.1染色原理大多數(shù)染料可將組織染成同一顏色的不同深度，例如：酸性品紅總是將組織染成不同色調(diào)的紅色，淡綠將組織染成不同色調(diào)的綠色。這些染色反應(yīng)最后目的物所呈現(xiàn)的顏色和染色劑的顏色相同，稱為正色或正染反應(yīng)。然而某些堿性染料可以將組織染成與染料不同的另一種顏色：如粘液用甲苯胺藍(lán)可染成紅色，而其余組織則染成不同色調(diào)的藍(lán)色。此種染色反應(yīng)最后目的物所呈現(xiàn)的顏色和染色劑當(dāng)初的顏色不同，則稱為變色反應(yīng)，也叫做異染現(xiàn)象。這種組織稱為顯示異染性，這種染料叫做異染性染料。

采用ATP酶法，用異染性染料甲苯胺藍(lán)顯示肌纖維類型的原理是肌原纖維ATP酶在酸性預(yù)孵育液的影響下，其不同肌原纖維的ATP酶活性產(chǎn)生了不同程度的抑制，孵育時(shí)，ATP酶水解孵育液中的ATP，生成無(wú)機(jī)磷酸，磷酸被Ca2+捕獲沉淀在酶活性部位，磷酸鈣與后來(lái)的染料結(jié)合，并以聚合體的形式存在于酶活性部位。ATP酶活性的不同造成了局部磷酸鈣沉淀和染料聚合體濃度的不同，從而呈現(xiàn)不同的顏色。因此影響肌纖維著色不同的最重要因素就是最初沉淀在每根肌纖維內(nèi)磷酸鈣含量的不同。在Ca2+存在的情況下，磷酸鈣是由肌纖維的ATP酶水解孵育液中的ATP產(chǎn)生無(wú)機(jī)磷酸與Ca2+結(jié)合生成的，也就是肌纖維ATP酶的活性決定了酶活性部位磷酸鈣沉淀的濃度，從而決定了最后的染色結(jié)果。I型纖維ATP酶活性抑制程度較輕，活性較強(qiáng)，獲得的磷酸鈣濃度最高，其次是IIB和IIC型，IIA型濃度最低。乙醇脫水中性樹(shù)膠封片后I型纖維綠松石（turquoise）色，即藍(lán)綠色，有深色的邊緣，染色不均，光鏡下容易區(qū)分；IIA-型纖維淺藍(lán)色（light blue）或粉紅色(pink)；IIB型纖維紫羅蘭 (violet) 色； IIC型纖維深藍(lán)色(dark blue)。II型纖維中，IIA顏色最淺，IIC型顏色最深，但其染色均勻，沒(méi)有深色邊緣，與I型纖維容易鑒別［6］。

異染性著色分為酒精穩(wěn)定型和酒精不穩(wěn)定型，依據(jù)是經(jīng)過(guò)常規(guī)的酒精脫水過(guò)程后其色調(diào)是否保持不變。本研究中，骨骼肌纖維的異染性著色為酒精不穩(wěn)定型，酒精有脫水和脫色的作用。染料與沉淀在ATP酶活性部位的磷酸鈣結(jié)合得并不牢固，酒精脫水時(shí)，部分染料也會(huì)被脫去，而且與酒精脫水時(shí)間正相關(guān)，如果時(shí)間夠長(zhǎng)，顏色會(huì)完全褪去。因此脫水過(guò)程要快，要產(chǎn)生穩(wěn)定的顏色并區(qū)分出不同類型肌纖維，嚴(yán)格控制這一步很重要。丙酮也可作為脫水劑，其去除較少的染料，平衡后，選擇乙醇為脫水劑是因?yàn)楸粔颦h(huán)保。

肌原纖維ATP酶的活性和溶液的pH值決定著染色結(jié)果。但溶液中溶質(zhì)的濃度也會(huì)對(duì)染色結(jié)果產(chǎn)生影響，特別是孵育液中的ATP二鈉鹽作為反應(yīng)的底物，其濃度會(huì)隨染色過(guò)程的進(jìn)行而減小，即使現(xiàn)用現(xiàn)配，同一批切片之間的的染色結(jié)果在色調(diào)上也會(huì)有所差異。但只要能夠?qū)⒉煌愋偷募±w維區(qū)分出來(lái)，實(shí)驗(yàn)就是成功的。

3.2種屬差異以前的研究都集中在哺乳動(dòng)物，本研究首次將哺乳動(dòng)物大鼠和兩棲動(dòng)物蟾蜍同時(shí)做對(duì)比研究。染色方案一可以區(qū)分四種主要的肌纖維類型：I、IIA、IIB和IIC，方案二可區(qū)分I、IIA和IIB3種肌纖維類型。兩個(gè)染色方案中，大鼠腓腸肌均在預(yù)孵育液pH值為4.35左右時(shí)出現(xiàn)最佳染色結(jié)果，與Ogilvie and Feeback［6］最后采用的方案的預(yù)孵育液pH為4.5～4.6（人骨骼肌標(biāo)本）并不一致，而與Konishi M等［7］改良的方案的預(yù)孵育液pH值為4.35（鼠骨骼肌標(biāo)本）一致。與大鼠相比，蟾蜍腓腸肌在預(yù)孵育液pH值較寬的范圍4.40～4.70都可以出現(xiàn)較好的染色結(jié)果。

從前人和本研究的結(jié)果可以看出，種屬差異的確存在，這要求在以后的研究中要注意這個(gè)問(wèn)題。這種種屬差異主要是源于不同動(dòng)物骨骼肌纖維ATP酶對(duì)酸性預(yù)孵育液的反應(yīng)和其生理特性的不同。

同樣是成年的大鼠和蟾蜍，其肌纖維直徑相差較大，參照附圖中的標(biāo)尺可以看出，蟾蜍肌纖維直徑是大鼠的2.5倍左右，大鼠肌纖維直徑40 μm左右，而蟾蜍肌纖維直徑100 μm左右。并且蟾蜍骨骼肌組織切片在晾干后，細(xì)胞出現(xiàn)很多“裂縫”，染色后依然存在，且快肌纖維較多。是否是因?yàn)閮蓷珓?dòng)物蟾蜍肌組織含水量較高而形成的，有待進(jìn)一步研究。

3.3注意要點(diǎn)

3.3.1組織速凍及冷凍切片及時(shí)妥當(dāng)速凍肌肉活檢組織，防止酶的失活及冰晶形成；選擇恰當(dāng)?shù)那衅瑴囟?，一般恒冷室溫度控制?20℃左右，溫度太高，切片容易皺折，溫度過(guò)低，切片容易產(chǎn)生破洞；切片后及時(shí)染色，以避免酶的擴(kuò)散或失活，影響結(jié)果。

3.3.1溶液的pH值溶液的pH值是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵因素，預(yù)孵育液和孵育液的pH值務(wù)必要準(zhǔn)確。要求:器皿潔凈；試劑稱量準(zhǔn)確；預(yù)孵育液、 孵育液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配；必備一臺(tái)精密酸度計(jì)，使用前要校準(zhǔn)，調(diào)節(jié)過(guò)程要認(rèn)真，保證溶液pH值的準(zhǔn)確性。

3.3.2脫水和封片脫水過(guò)程應(yīng)嚴(yán)格控制，以保持色調(diào)穩(wěn)定；不可用水性介質(zhì)（如明膠等）封片，因其可使染料從肌纖維上洗提出來(lái)。

4結(jié)論

采用ATP酶法，用異染性染料甲苯胺藍(lán)，染色方案一可以在一張切片上同時(shí)顯示四種肌纖維類型：I、IIA、IIB和IIC；染色方案二可以區(qū)分三種：I、IIA和IIB，色調(diào)與方案一基本一致。如果實(shí)驗(yàn)不需要區(qū)分IIC型纖維或?qū)嶒?yàn)經(jīng)費(fèi)有限，可采用方案二，其所用試劑價(jià)廉，染色結(jié)果也相對(duì)理想。

兩種方案中，大鼠腓腸肌均在預(yù)孵育液pH值為4.35左右時(shí)出現(xiàn)最佳染色結(jié)果，蟾蜍腓腸肌在預(yù)孵育液pH值較寬的范圍4.40~4.70都可以出現(xiàn)較好的染色結(jié)果。大鼠和蟾蜍的染色條件稍有差別，存在種屬差異。

不同類型的骨骼肌纖維具有不同的形態(tài)、機(jī)能和代謝特征，這在運(yùn)動(dòng)實(shí)踐中具有十分重要的意義。優(yōu)秀運(yùn)動(dòng)員骨骼肌纖維類型的分布特征表明運(yùn)動(dòng)能力與肌纖維類型密切相關(guān)。由于人體骨骼肌纖維類型很大程度上取決于遺傳，因此，肌纖維類型被認(rèn)為是運(yùn)動(dòng)員科學(xué)選材的一項(xiàng)重要指標(biāo)。另外在一些神經(jīng)肌肉疾病的診斷和組織學(xué)研究中都需要區(qū)分肌纖維類型，以進(jìn)行對(duì)比分析。希望本文能為相關(guān)實(shí)踐和研究提供借鑒和參考。

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