新疆棉花立枯病根際拮抗放線菌的篩選

紀春艷　王新榮　程路明　王純利

摘要：從采集的新疆棉苗根際土樣中經(jīng)分離、純化獲得優(yōu)勢放線菌菌株95個，采用平板對峙培養(yǎng)法對立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)進行根際拮抗放線菌的篩選。結(jié)果表明．共獲得根際拮抗放線菌菌株22株，其中菌株M-1抑菌譜廣，抑菌活性強，熱穩(wěn)定性較好，是一株具有良好應(yīng)用潛力的防治棉花立枯病的生防菌。

關(guān)鍵詞：棉花；拮抗放線菌；立枯絲核菌；抑菌活性

中圖分類號：Q 939．92

微生物農(nóng)藥作為生物農(nóng)藥的重要類群，以其低毒低殘留、對非靶標生物及環(huán)境安全等特點而備受重視。放線菌是微生物農(nóng)藥的重要來源，分布廣泛，種類繁多，篩選出的活性物質(zhì)具有產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)勢。放線菌是植物根際微生物群落的重要組成部分，通過有效定殖，重寄生，產(chǎn)生抗生素、植物生長調(diào)節(jié)素，分泌幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶、過氧化物酶等機制促進植株生長，抵抗病原菌的侵染。放線菌作為生防菌已在生產(chǎn)上被成功地應(yīng)用，如土壤放線桿菌(Agrobacteriurn radiobacter 84)，利用其活菌制劑及其產(chǎn)生的抗生素(agriOcin-84)能夠有效防治核果和玫瑰根痛病。由立枯絲核菌(Rhizoctonia so-lani)引起的棉花立枯病是新疆棉花苗期的重要病害，對棉田的高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)帶來嚴重影響。本研究從新疆主要棉花種植區(qū)的棉苗根際篩選到一批對立枯絲核菌抑菌效果較好的放線菌菌株，并對其中抑菌譜廣、抑菌活性強的菌株M-1進行穩(wěn)定性的初步研究，現(xiàn)報道如下。

1材料與方法

1．1供試病原菌

立枯絲核菌：Rhizoctonia solani AG-4；尖孢鐮刀菌：Fusarium oxysporum；大麗輪枝菌：Verticillium dahliae Kleb；根串珠霉：Thielavi-opsis basicola；苧麻疫霉：Phytophthora boehmer-iae Sawada，以上菌株均由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理室提供。

1．2培養(yǎng)基

土壤分離培養(yǎng)基：高氏1號培養(yǎng)基：瓊脂15 g，可浴性淀粉20 g，NaC1 0.5 g，KNO₃1 g，K₂HPO₄·3H₂O 0.5 g，MgSO₄·7H₂O 0.5 g，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.01 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.5。

發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉45 g，花生餅粉22 g，(NH₄)2SO₄2.6 g，NaCl 2.6 g，CaCO₃2.6 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.2。

馬鈴薯瓊脂糖培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.0。

1．3棉苗根際土樣采集及根際放線菌的分離、培養(yǎng)

在新疆阿克蘇、昌吉、石河子、瑪納斯、呼圖壁、博樂6個棉花種植區(qū)進行采樣，采集棉花立枯病發(fā)病較嚴重的棉田中的健康棉苗(附帶根圍土)，裝入滅菌紙袋，低溫保存，進行分離。

將棉苗根上松散的附著土抖掉，自根莖處剪斷，稱取1 g根，用無菌水漂洗3次，置于9 mL無菌水的離心管中，制備不同稀釋液的根際土壤溶液，涂布于高氏Ⅰ號平板，28℃培養(yǎng)，觀察、計數(shù)，進行根際放線菌含菌量的測定，挑取不同形態(tài)的菌落畫線純化，鏡檢、保存。

對純化的根際放線菌菌株進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，250 mL三角瓶中裝入40 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量ф=10％，搖床轉(zhuǎn)速160 r／min，28℃振蕩培養(yǎng)4 d。

1．4拮抗放線菌的篩選

采用平板對峙培養(yǎng)法，將已培養(yǎng)3 d的立枯絲核菌用5 mm的打孔器打成菌絲塊，移到PDA平板的中央，將待篩選的放線菌的發(fā)酵培養(yǎng)液在離立枯絲核菌等距離的3個角上接種，每個角上放置的5 mm濾紙片上各滴加發(fā)酵液50μL，28℃培養(yǎng)，測量抑菌帶的寬度，觀察各放線菌菌株對立枯絲核菌的抑菌作用，選擇抑菌作用明顯的菌株作為拮抗放線菌。每個處理重復(fù)3次，以不接供試放線菌菌株的平板作為對照(CK)。

1．5抑菌譜的測定

將1.4中獲得的初篩拮抗放線菌菌株分別與棉花枯萎病(尖孢鐮刀菌)、棉花黃萎病(大麗輪枝菌)、棉花黑根腐病(根串珠霉)以及棉花疫病(苧麻疫霉)4種棉花病害的病原菌進行平板對峙培養(yǎng)，測定抑菌譜。

1．6菌株M-1穩(wěn)定性的測定

將1.5中獲得的抑菌譜廣、拮抗活性強的菌株M-1發(fā)酵液經(jīng)離心后所得的上清液進行以下穩(wěn)定性測定。以發(fā)酵原液作為對照，重復(fù)3次。

1．6．1熱穩(wěn)定性測定

將M-1發(fā)酵上清液分別于60、80、100、121℃處理60 min，對立枯絲核菌對峙培養(yǎng)，測定其抑菌圈的直徑。

1．6．2pH穩(wěn)定性

將M-1發(fā)酵上清液的pH值分別調(diào)至2、4、6、8、10、12后，對立枯絲核菌對峙培養(yǎng)，測定其抑菌圈的直徑。

1．6．3紫外光穩(wěn)定性

將M-1發(fā)酵上清液置于30 w紫外光下，距離30 cm，照射12 h后，對立枯絲核菌對峙培養(yǎng)，測定其抑菌圈的直徑。

2結(jié)果與分析

2．1棉苗根際放線菌分離和拮抗放線菌初步篩選

由表1可知，從阿克蘇、昌吉、石河子、瑪納斯、呼圖壁、博樂6個棉花種植區(qū)共采集棉苗根際土樣48份，不同地區(qū)的棉苗根際放線菌種群密度差異較大，其中石河子根際土壤的放線菌含量最高，而阿克蘇的最低。經(jīng)分離、純化，共獲得優(yōu)勢放線菌菌株95株，其中，瑪納斯土樣中獲得的放線菌菌株數(shù)較多，雖然石河子根際土壤中的放線菌含量最高，但其獲得的優(yōu)勢放線菌菌株數(shù)最少，可能其根際放線菌的主要類群相對其他地區(qū)較單一。采用平板對峙法，測定95個放線菌菌株對立枯絲核菌的抑菌作用，初步篩選到有抑菌作用的拮抗放線菌22株，約占分離總株數(shù)的23％，初篩拮抗細菌菌株的抑菌活性強弱有所不同，可以分為3類：抑菌活性強(3級)的12株，占54％；抑菌活性較強(2級)的3株，占14％；抑菌活性較弱(1級)的7株，占32％。

2．2初篩拮抗放線菌菌株的抑菌譜測定結(jié)果

挑選2.1中的初篩放線菌22株，對4種棉花重要病害的病原菌進行抑菌譜的測定，結(jié)果見表2。由表2可知，抑菌譜可分為3類：(1)抑菌譜廣，對立枯絲核菌及其他供試菌株中的3個菌株均有很強的抑菌活性(3級)，如M-1，B-14等；(2)抑菌譜較廣，但對供試菌株的抑菌活性不一致，如：AF-2，M-4等；(3)抑菌譜窄，抑菌活性較低，僅對立枯絲核菌具有抑菌活性，而對其他供試菌株無抑菌活性，如AF-8，H-12。

2．3菌株M-1的穩(wěn)定性

由圖1可知，與對照相比，M-1發(fā)酵液在80℃以下溫度處理60 min，對其抑菌活性沒有影響，經(jīng)121℃處理60 min后，對立枯絲核菌仍然具有抑菌活性，M-1具有較好的熱穩(wěn)定性。

與對照(pH7.2下，抑菌圈直徑為22.5 mm)相比，pH變化對M-1抑菌活性的影響如表3所示，在pH6～8之間穩(wěn)定，pH4、pHl2下M-1的抑菌活性明顯降低，pH2時活性完全喪失。

將M-1發(fā)酵液經(jīng)紫外光照射12 h后，抑菌圈的直徑為15.5 mm，對立枯絲核菌的抑菌活性明顯下降。

3討論

近年利用拈抗細菌對新疆棉花立枯病進行生物防治的研究已有相關(guān)報道。張亞平等從北疆棉花根際土壤中篩選到的芽孢桿菌7B-1能夠引起立枯絲核菌菌絲溶解和畸形；羅明等從新疆不同種植區(qū)的棉花植株組織中分離獲得一批對立枯絲核菌抑菌作用較強的菌株；閻小雪等篩選獲得對立枯絲核菌溫室防效較好的10株芽孢桿菌，其中有3株的田間小區(qū)試驗防效較好。有關(guān)對新疆棉花立枯病進行拮抗放線菌篩選的研究報道目前尚未見到。作者從新疆主要棉花種植區(qū)的棉苗根際篩選獲得一批對立枯絲核菌抑菌效果較好的放線菌菌株，其中菌株M-1對立枯絲核菌、大麗輪枝菌、根串珠霉以及苧麻疫霉的抑菌活性均很高，抑菌譜廣，熱穩(wěn)定性較好，最適合的pH范圍為6～8，對紫外光敏感。這些為該菌株有效活性物質(zhì)的分離純化提供了初步理論參考，下一步將對該菌株活性物質(zhì)的純化鑒定、理化性質(zhì)、最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化等進行深入研究。棉花立枯病是一類土傳苗期病害，植株在苗期的生長狀況與其抗病性密切相關(guān)，有必要對菌株M-1在棉株根部的定殖、是否具有促生長、誘導(dǎo)棉株抗病性產(chǎn)生等抑病機制進行系統(tǒng)研究，從而為大田應(yīng)用提供必要的理論依據(jù)。