改造病毒基因組增強(qiáng)病毒殺蟲劑殺蟲效率研究進(jìn)展

蔣　洪　周　亮　張珈敏　胡遠(yuǎn)揚(yáng)

摘要：由于基因工程技術(shù)的發(fā)展和安全性研究的深入，以重組桿狀病毒為主的重組昆蟲病毒殺蟲劑的應(yīng)用正面臨著突破。文章綜述了通過修飾或刪除昆蟲病毒某些基因、插入控制宿主發(fā)育、代謝激素或酶的基因、刪除、修飾昆蟲病毒基因組中特定的基因以擴(kuò)大宿主域、應(yīng)用RNA干擾技術(shù)提高昆蟲病毒殺蟲效率等構(gòu)建重組昆蟲病毒殺蟲劑的技術(shù)路線，展望重組病毒殺蟲劑的發(fā)展趨勢。

關(guān)鍵詞：重組病毒殺蟲劑；桿狀病毒；生物防治；殺蟲效率

中圖分類號：S 476．13

昆蟲病毒是以昆蟲為宿主，并可以在其種群中引發(fā)流行病的一類病毒。與大量使用的傳統(tǒng)化學(xué)殺蟲劑相比，以昆蟲病毒為有效成分的病毒殺蟲劑具有以下特點(diǎn)：防治效率高，不僅使用劑量極低，而且可以達(dá)到持續(xù)控制的效果；對人、畜、非靶標(biāo)動物安全，保護(hù)天敵；極大減少了環(huán)境、食物的化學(xué)品殘留；增加了應(yīng)用環(huán)境的生物多樣性；劑型便于儲運(yùn)，有較長的貨架壽命；適合常規(guī)施藥方法，與害蟲綜合防治系統(tǒng)相容性好，正顯示日益強(qiáng)大的生命力。

但是，野生性的昆蟲病毒用作殺蟲劑也存在很多限制。與化學(xué)殺蟲劑相比，病毒殺蟲劑殺蟲速度慢，在害蟲被控制以前，可能已經(jīng)造成了較大的損失。病毒殺蟲劑還有對紫外線敏感，需要活體增殖等缺點(diǎn)。另外，病毒對宿主的專一性導(dǎo)致的殺蟲譜狹窄也限制了其作為生物防治因子的廣泛應(yīng)用。

為提高昆蟲病毒對宿主的殺蟲效率，應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，可以通過昆蟲病毒基因組的基因工程提高病毒殺蟲劑的殺蟲效率、拓寬殺蟲譜。前文“應(yīng)用昆蟲毒素基因構(gòu)建重組病毒殺蟲劑研究進(jìn)展”總結(jié)了插入昆蟲病毒基因組以構(gòu)建重組病毒殺蟲劑的技術(shù)路線，現(xiàn)將應(yīng)用調(diào)控昆蟲代謝、發(fā)育的基因、某些酶基因等外源基因重組昆蟲病毒提升控制宿主的效率、或通過刪除、修飾昆蟲病毒基因組內(nèi)的某些基因增強(qiáng)病毒的殺蟲效率、擴(kuò)大病毒的宿主域的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，全面反映重組病毒殺蟲劑的研究進(jìn)展。

1修飾或刪除昆蟲病毒某些基因構(gòu)建重組昆蟲病毒

寄生于宿主細(xì)胞內(nèi)的昆蟲病毒，為了完成其生命活動和維持種群的增長，在與宿主長期的協(xié)同進(jìn)化過程中，獲得了一些對宿主生理調(diào)控的功能，以使宿主生命維持相對長的時間，有利于昆蟲病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)完成增殖過程。例如AcMNPV基因組中的p35和iap基因可以抑制病毒感染引發(fā)的宿主細(xì)胞凋亡過程，關(guān)閉宿主細(xì)胞抗病毒機(jī)制。AcMNPV基因組中UDP葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因(ecdysterioid UDP-giucoferase gene，egt)編碼蛻皮激素是一個重要的桿狀病毒調(diào)控基因。它可以通過把葡萄糖、半乳糖與蛻皮甾類激素偶聯(lián)而使后者失活，抑制宿主蛻皮和化蛹，以利于病毒在幼蟲體內(nèi)增殖。研究表明，將egt基因失活構(gòu)建的重組AcMNNPV可以使草地夜蛾(Spodoptera fru-giperda)幼蟲的死亡速度比野生型縮短30％，同時感染的幼蟲取食量顯著減少。插入外源片段使egt基因失活構(gòu)建的重組AgMNPV感染大豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)3齡幼蟲，與野生型AgM-NPV相比，半數(shù)死亡濃度LC₅₀降低3.9倍，死亡時間也顯著提前。

缺失egt基因的重組桿狀病毒的作用效果與幼蟲的齡期有關(guān)，主要影響5齡幼蟲的存活時間和取食量，可以使危害最大的5齡幼蟲半數(shù)死亡時間(LT₅₀)縮短33％，半數(shù)停止攝食時間(FT₅₀)縮短32％。在病毒基因組編碼egt的閱讀框ORF中插入昆蟲特異性毒素基因構(gòu)建重組桿狀病毒，在失活egt基因的同時表達(dá)外源昆蟲毒素基因可以達(dá)到雙重增效目的。如插入螨蟲的tox34基因并使美洲棉鈴蟲核型多角體病毒(HzNPV)的egt基因失活所構(gòu)建的重組HzNPV，感染美洲棉鈴蟲(He-liothis.zea)結(jié)果顯示，ET₅₀縮短到40h以內(nèi)，只有野生型的40％。

昆蟲感染桿狀病毒的后期癥狀為蟲體發(fā)生液化，這是由于病毒編碼的幾丁質(zhì)酶和組織蛋白酶表達(dá)后起的作用。桿狀病毒幾丁質(zhì)酶基因C末端有一個編碼細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號的KDEL閱讀框，其功能是使活化后的幾丁質(zhì)酶定位于宿主細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。刪除KDEL閱讀框構(gòu)建的重組病毒AcM-NPV感染昆蟲細(xì)胞后，幾丁質(zhì)酶散布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，并可以分泌出細(xì)胞外的培養(yǎng)基中。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生型AcMNPV比較，基因組中刪除KDEL閱讀框的重組AcMNPV病毒感染粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)的半數(shù)死亡時間LT₅₀從69 h縮短到61 h，半數(shù)致死劑量(LD₅₀)和對作物的損失都顯著降低。

2插入控制宿主發(fā)育、代謝激素或酶的基因構(gòu)建重組昆蟲病毒

保幼激素(juvenile hormone，JH)是調(diào)控昆蟲體內(nèi)組織分化的激素，起著保持幼蟲狀態(tài)，推遲化蛹的功能。保幼激素酯酶(juvenile hormone esterase，JHE)則切割JH的甲基酯，使其失活。利用重組昆蟲病毒在宿主體內(nèi)過量表達(dá)JHE，降低JH滴度，加速幼蟲的早熟和化蛹是構(gòu)建重組桿狀病毒的另一條途徑。研究顯示，將在不同位置突變修飾的2個JH基因插入AcMNPV的p10啟動子下游構(gòu)建重組病毒AcJHE-KK和AcJHE-sG，測試結(jié)果均表現(xiàn)出良好的殺蟲效果。與野生型相比，可以降低煙芽夜蛾(Heliothis virescens)對萵苣損失的66％和50％。

鱗翅目昆蟲組織的周圍由基底膜包圍，起著阻擋病原體侵入和病毒感染擴(kuò)散的功能。在桿狀病毒基因組中插入相關(guān)的蛋白酶基因，在宿主體內(nèi)表達(dá)后，可以酶解宿主昆蟲組織的基底膜，從而提高桿狀病毒的持續(xù)感染效果。試驗證實，將來源于蠅類的蛋白酶基因ScathL(組織蛋白酶L，屬于半胱氨酸蛋白酶)插入在AcMNPV的p6.9啟動子下游構(gòu)建重組AcMNPV，與野生型相比，可以縮短煙芽夜蛾(H.virescens)存活時間50％，并且比在同樣位置插入蝎LqIT2毒素基因構(gòu)建的重組病毒縮短30％。進(jìn)一步研究顯示，該插入蛋白酶基因的重組AcMNPV攝食萵苣的量只有野生型的1／26。但是進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，表達(dá)有效的或失活的ScathL基因并沒有對重組的AcMNPV病毒粒子在煙芽夜蛾幼蟲體內(nèi)分布或定向擴(kuò)散有明顯影響，基底膜能否作為昆蟲病毒在幼蟲體內(nèi)擴(kuò)散的阻擋屏障有待進(jìn)一步研究。

3刪除、修飾病毒基因組中特定的基因以擴(kuò)大宿主域。拓寬殺蟲譜

昆蟲病毒對宿主的專一性決定了其只能感染特定的一種或幾種宿主，限制了推廣應(yīng)用。采用基因工程手段，通過改造桿狀病毒基因組，可以擴(kuò)大其宿主域，從而拓寬病毒殺蟲劑的應(yīng)用。

昆蟲病毒進(jìn)入細(xì)胞的方式比較特殊，一般不需

要特異性的受體，或者與其結(jié)合的受體在動物細(xì)胞膜上廣泛存在，例如AcMNPV可以進(jìn)入某些非允許的昆蟲和哺乳動物細(xì)胞。研究顯示，昆蟲病毒對宿主的專一性主要取決于病毒基因組在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制和晚期基因的表達(dá)，昆蟲體內(nèi)的免疫系統(tǒng)也有作用心。

目前已知影響桿狀病毒宿主的基因有p143，p35，hrf-1等，重組此類基因有可能擴(kuò)展宿主域。p143是桿狀病毒基因組中編碼解旋酶的基因，將AcMNPV的p143置換成BmNPV的p143構(gòu)建重組AcMNPV，試驗證明，該重組AcMNPV的宿主域擴(kuò)展到家蠶細(xì)胞系和幼蟲。插入舞毒蛾核型多角體病毒(LdNPV)的hrf-1基因構(gòu)建重組AcMNPV，試驗結(jié)果顯示該重組病毒可以經(jīng)口感染舞毒蛾(gypsy moth)，但是不能產(chǎn)生持續(xù)性的感染，可能是由于昆蟲細(xì)胞膜對非特異病毒的擴(kuò)散有阻擋作用。

4應(yīng)用RNA干擾技術(shù)提高昆蟲病毒殺蟲效率

利用桿狀病毒載體在宿主體內(nèi)轉(zhuǎn)錄一段特定的RNA序列，該序列與宿主某個關(guān)鍵的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(mRNA)互補(bǔ)，宿主這個在生長、發(fā)育過程中起重要作用的mRNA與載體轉(zhuǎn)錄的RNA互補(bǔ)后，失去翻譯功能，從而使該基因沉默。該技術(shù)路線直接作用于靶基因的轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)，具有安全性好、作用時間提前等特點(diǎn)，是比較新的一條技術(shù)路線。

c-myc是廣泛存在脊椎動物和某些無脊椎動物體內(nèi)的一個重要基因，其編碼的磷酸化核蛋白具有調(diào)控細(xì)胞分裂、休眠、分化、死亡等多種作用。將該基因中一段保守序列的互補(bǔ)DNA序列插入Ac-MNPV多角體啟動子下游構(gòu)建重組病毒，感染草地貪夜蛾幼蟲。試驗顯示，感染3 d后，處理組75％的宿主幼蟲停止攝食，野生型AcMNPV同時間只有25％的幼蟲停止攝食，感染3 d通常是多角體啟動子開始表達(dá)的時間。處理組幼蟲停止攝食后，2 d內(nèi)陸續(xù)死亡，比對照的野生型病毒感染組死亡時間提前1 d多。結(jié)果證實，利用RNA干擾技術(shù)可以顯著縮短宿主昆蟲停止攝食時間，并且幼蟲的蟲齡越小，效果越顯著。

5結(jié)語

病毒殺蟲劑規(guī)?；a(chǎn)目前都以蟲體增殖的方式進(jìn)行，具有投資少、生產(chǎn)工藝簡單、成本適中等優(yōu)點(diǎn)。重組病毒由于表達(dá)了外源基因，增殖時宿主表現(xiàn)出進(jìn)食少、發(fā)育緩慢、蟲體小、死亡快等癥狀，因而影響重組病毒的收獲。雖然重組病毒可以大大提高病毒殺蟲劑的控制效率，在其大規(guī)模應(yīng)用之前，還必須解決生產(chǎn)的難題，達(dá)到商品化生產(chǎn)的要求。

隨著昆蟲病毒分子生物學(xué)研究的深入，可以預(yù)見將有更廣泛的昆蟲病毒通過基因工程提高其防治害蟲的應(yīng)用潛力并被批準(zhǔn)大田釋放研究，為農(nóng)林害蟲和城市害蟲防治提供環(huán)境友好的生物防治技術(shù)。